Misurazione Concentrazione Catalasi: Metodi e Importanza

La catalasi è un catalizzatore biologico (organico). Questo enzima è uno dei catalizzatori più potenti conosciuti ed ha effetti benefici sul corpo umano ed è cruciale per la vita. La catalasi agisce come catalizzatore nell'accelerare la scomposizione del perossido di idrogeno. Il perossido di idrogeno è un sottoprodotto metabolico che è velenoso per le cellule se non rimosso. La catalasi assiste nella scomposizione del perossido di idrogeno in acqua e ossigeno. La catalasi aiuta anche nell'ossidazione di altre tossine come fenoli, acido formico, formaldeide e alcoli.

Occorrente

• Due 110 mL di cromogeno in tampone fosfato
• 300 µL substrato - perossido di idrogeno al 30%
• 400 µL HRP - perossidasi di rafano in tampone fosfato
• 60 mL tampone fosfato
• 250 mL diluente campione surfattante in tampone fosfato
• Due 30 mL diluente substrato tampone fosfato
• Due 30 mL reagente stop - azide di sodio
• Due fiale 160 U/fiala catalasi standard
• Spettrofotometro
• Pipette regolabili 10 µL
• Cuvette spettrofotometriche a cammino ottico 1 cm
• Microtubi polipropilene 1,5 mL con tappo
• Provette - 12x75 mm (2,5 mL ciascuna)
• Timer
• Acqua deionizzata

Istruzioni

1. Prepara lo stock di catalasi che misurerai aggiungendo 200 microlitri (µL) di acqua deionizzata alle concentrazioni di catalasi in fiale da 50 millilitri (ml). Il livello di concentrazione della catalasi dovrebbe essere 160 unità per millilitro (U/ml).
2. Aggiungi 30 µL di catalasi diluita nelle provette. Aggiungi 500 µL del substrato (perossido di idrogeno - 10 mM H2O2) in ogni provetta. Fai attenzione a non schizzare il perossido di idrogeno quando lavori con esso.
3. Incuba ogni singola provetta per un minuto a temperatura ambiente.
4. Aggiungi 500 µL di reagente a ogni fiala. Chiudi ogni fiala e mescola invertendo la fiala su e giù. Non vorticare la miscela, scuotere la fiala o mescolarla con un oggetto.
5. Aggiungi 20 µL di ogni miscela di reazione nelle provette. Aggiungi 2 millilitri di reagente HRP in ogni provetta. Di nuovo, mescola la soluzione invertendo le provette più volte.
6. Incuba la soluzione di nuovo, questa volta per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Leggi il livello di assorbanza della soluzione con uno spettrofotometro. Lo spettrofotometro misura le lunghezze d'onda della luce per determinare esattamente quali sostanze sono presenti e a quali concentrazioni. Questo metodo fornirà una lettura accurata delle concentrazioni di catalasi. L'informazione è utile nel contesto dell'interazione della catalasi con il perossido di idrogeno, come in questo esperimento, e come avviene naturalmente nel corpo umano.