Protocollo Microsomi Epatici: Guida per la Ricerca sul Metabolismo dei Farmaci
Ruolo dei Microsomi Epatici
microsomi sono vescicole derivate dal reticolo endoplasmatico liscio (frazionamento differenziale omogenato epatico). Contengono enzimi Fase I (CYP450 + reduttasi CPR, citocromo b5) e Fase II (UGT, SULT, GST - quest'ultime richiedono cofattori solubili citosolici). Modello in vitro standard per: cinetiche metaboliche (Km, Vmax, Clint), identificazione metaboliti, inibizione/induzione CYP (DDI prediction), fenotipizzazione, scaling in vivo (IVIVE).
Protocollo Base (Incubazione Standard)
- Preparare miscela incubazione: Buffer (100 mM fosfato pH 7.4), MgCl₂ (3-5 mM), microsomi (0.1-1 mg proteina/mL), substrato (farmaco, range concentrazioni), NADPH (1-2 mM, rigenerante: sistema NADP⁺/G6P/G6PDH per incubazioni lunghe).
- Pre-incubare microsomi + buffer + substrato 3-5 min a 37°C.
- Iniziare reazione aggiungendo NADPH (time zero).
- Incubare 37°C, agitazione delicata, tempi predeterminati (es. 0, 5, 10, 20, 30, 60 min).
- Arrestare reazione: aggiungere ugual volume solvente organico freddo (acetonitrile/metanolo con internal standard) o acido perclorico. Centrifugare 14.000 × g, 10 min, 4°C.
- Analizzare surnatante: LC-MS/MS (quantitativo), HRMS (identificazione metaboliti).
- Controllo negativo: Stesso protocollo senza NADPH (o con NADPH omesso, sostituito da buffer). Confronta picchi: formazione metaboliti NADPH-dipendente = metabolismo Fase I ossidativo.
Ottimizzazioni Chiave (Variazioni del Protocollo)
Forza di Centrifugazione nel Frazionamento
Durante preparazione microsomi da fegato fresco/congelato: centrifugazione differenziale (es. 9.000 g 20 min → pellet mitocondri; 105.000 g 60 min → pellet microsomi). Ridurre forza g finale (es. 100.000 vs 105.000 g) può aumentare purezza microsomi (meno contaminazione mitocondriale/frammenti membranosi) → attività specifica CYP più alta per mg proteina.
Soluzioni Tamponi: Saccarosio
Omogenizzazione: buffer fosfato/saccarosio (0.25 M saccarosio, 10 mM Tris/HEPES pH 7.4) vs solo buffer. Presenza saccarosio → protegge integrità membrane ER, mantiene latenti enzimi, aumenta attività reduttasi (CPR) e CYP. (Center for Human Toxicology, Univ. Utah).
Omogenizzazione: Numero Colpi
Omogenizzatore manuale (Dounce/teflon-pestle): 10 colpi vs 6-8 → maggiore rottura epatociti → più microsomi recuperati → attività reduttasi/CYP superiore. Ottimizzare per tessuto (fresco vs congelato, specie).
Controllo Qualità Microsomi (Lot Release)
- Contenuto proteico (BCA/Lowry).
- Contenuto CYP totale (spettro CO-differenza: 450 nm peak vs 420 nm P420 inattivo).
- Attività marker: Testosterone 6β-idrossilazione (CYP3A4), Bufuralolo 1'-idrossilazione (CYP2D6), Diclofenac 4'-idrossilazione (CYP2C9), S-Mephenitoina 4'-idrossilazione (CYP2C19), Coumarina 7-idrossilazione (CYP2A6), Midazolam 1'-idrossilazione (CYP3A4/5).
- Attività reduttasi CPR (citocromo c riduzione).
- Attività UGT (se Fase II): 4-MU glucuronidazione.
- Sterilità, micoplasma, endotoxina.
Note Pratiche
- Specie: Umano (HLM), Rat (RLM), Cane (DLM), Scimmia (MLM), Topo (MLM) - cinetiche diverse.
- Pooled (donatori multipli) vs Individuali: Pooled = media popolazione per DDI; Individuali = variabilità interindividuale.
- Conservazione: -80°C o LN2. Evitare cicli freeze-thaw.
- Cofattori Fase II: UDPGA (UGT), PAPS (SULT), GSH (GST) - aggiungere fresh, instabili.