Cellule Mononucleate del Sangue Periferico (PBMC): Isolamento e Criopreservazione

Cosa Sono i PBMC

PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) = Linfociti (T, B, NK) + Monociti. Isolati da sangue intero per: immunofenotipizzazione (flow cytometry), test funzionali (proliferazione, citochine, citotossicità), genomica/trascrittomica single-cell, biobanking per trial vaccini/immunoterapie (CAR-T, checkpoint inhibitors).

Protocollo Standard: Isolamento + Congelamento

Materiali

• Sangue intero anticoagulato (eparina sodica, citrato, EDTA - *eparina preferita per funzione*)
• Mezzo di separazione a gradiente di densità (Ficoll-Paque PLUS, Lymphoprep, Histopaque-1077 - densità 1.077 g/mL)
• Tubuli conici 50 mL
• Centrifuga (swing-out rotor)
• PBS / RPMI 1640 senza siero
• Mezzo congelamento: 90% FBS (o siero umano AB) + 10% DMSO (o 5% DMSO + 5% glicerolo, o mezzi commerciali serum-free es. CryoStor CS10)
• Criovial 1-2 mL
• Contenitore raffreddamento controllato (Mr. Frosty / CoolCell) o -80°C overnight → azoto liquido (vapore o liquido, -150°C / -196°C).

Procedimento

1. Preparazione tubi: Aggiungere 15 mL mezzo separazione per tubo 50 mL. (Rapporto sangue:mezzo ~ 1:1 a 1:2).
2. Stratificazione: Versare lentamente sangue diluito 1:1 con PBS/RPMI lungo parete tubo sopra mezzo separazione. Evitare miscelazione.
3. Centrifugazione: 400-800 × g, 20-30 min, freno SPENTO (brake off), temperatura ambiente. 4 strati: plasma (sopra), anello PBMC (buffy coat, interfaccia), mezzo separazione, granulociti/eritrociti (pellet).
4. Raccolta PBMC: Aspirare interfaccia con pipetta/Pasteur. Trasferire in tubo pulito.
5. Lavaggi (x3): Riempire tubo PBS/RPMI, centrifugare 300-400 × g, 10 min, freno ON. Rimuovere surnatante. Risospendere. *Lavaggio 1: rimuove piastrine (bassissima densità). Lavaggi 2-3: rimuove mezzo separazione.*
6. Conteggio e vitalità: Tripan blu / contatore automatico (es. Countess, NucleoCounter). Target: > 90% vitalità, > 1×10⁶ cell/mL.
7. Risospensione in mezzo congelamento: Concentrazione finale 5-10 × 10⁶ cell/mL (1 mL/criovial).
8. Aliquotaggio: 1 mL/criovial. Etichettare: ID, data, tipo cellula, conto, vitalità, operatore.
9. Congelamento a velocità controllata (-1°C/min): Mr. Frosty (isopropanolo) a -80°C overnight. Critico per vitalità post-scongelamento.
10. Trasferimento in azoto liquido (vapore -150°C o liquido -196°C) per stoccaggio long-term. Inventario digitale obbligatorio.

Scongelamento Sicuro (Thawing)

1. Criovial da azoto liquido → bagno d'acqua 37°C (agitare delicatamente) finché ultimo cristallo di ghiaccio scompare (1-2 min max). Non superare 2 min.
2. Trasferire in tubo 15/50 mL. Aggiungere goccia a goccia mezzo caldo (RPMI + 10-20% FBS + DNasi I 10-25 U/mL se aggregati) mentre agiti delicatamente. Diluizione progressiva previene shock osmotico.
3. Centrifugare 300 × g, 7-10 min. Rimuovere surnatante (DMSO tossico).
4. Risospensione in mezzo lavoro. Conteggio + vitalità (7-AAD/DAPI/PI per accuratezza post-thaw).
5. Riposo 12-18h (overnight) in incubatrice 37°C, 5% CO₂ prima di assay funzionali → recupero metabolico, downregolazione geni stress, ristabilimento funzioni effettore.

Controllo Qualità

• Vitalità post-thaw > 80% (target > 90%).
• Recupero cellulare > 70% conteggio pre-freeze.
• Fenotipo superficie (CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, CD14) stabile.
• Funzione: stimolazione PMA/ionomycin / peptidi → citochine (ICS/ELISpot) comparabile fresh.