Tecnologie di Amplificazione Nucleica: Applicazioni in Diagnostica e Terapia Genica
Principio Generale
amplificazione nucleica (PCR, LAMP, RPA, NASBA, HDA, RCA, SDA, TMA, CRISPR-based) genera copie esponenziali di una sequenza bersaglio (DNA/RNA). Permette rilevazione ultrasensibile, quantificazione, genotipizzazione, clonaggio, editing. Catalizzatori: cicli termici (PCR), enzimi isothermici (Bst, T7 RNA pol, Ricombinasi), pressione/meccanica (emerging).
Applicazioni Chiave
1. Amplificazione DNA: Diagnostica Malattie Infettive
- PCR real-time / qPCR: Gold standard. Rilevazione Neisseria gonorrhoeae & Chlamydia trachomatis (IST più prevalenti) in poche ore vs giorni coltura. Target: geni criptici plasmidici (CT) / opa/porA (NG).
- Displacement amplification su chip (microfluidica): Amplificazione isoterma su biosensori portatili (point-of-care). Biotin-streptavidin capture su superfici.
2. Amplificazione per Virus e Anticorpi
- Virus: diversità ricombinazione, tropismo cellulare. Terapia genica umana: splitting/riassemblaggio genotipi (vettori virali AAV, lentivirali, adenovirali).
- Identificazione 8 virus geneticamente distinti (es. sierotipi AAV per targeting tessutale).
- Ingegneria virale: proteine + patogeni ematici in epatociti → particelle virali. Amplificazione → varianti con proprietà anticorpali (es. nanobodies, scFv espressi da vettori virali). Test in modelli murini (polmone) → efficacia superiore vs virus wt.
3. Amplificazione in Emofilia (Gene Therapy)
- Trasferimento gene fattore VIII (emofilia A) o IX (emofilia B) via AAV → epatociti esprimono fattore coagulante.
- Monitoraggio: prodotto transgene (fattore VIII/IX espresso) in plasma. Efficacia ∝ livello fattore.
- Classificazione gravità emofilia:
- Severa: Fattore < 1% UI/dL → sanguinamenti spontanei frequenti (articolari, muscolari).
- Moderata: 1-5% → sanguinamenti post-trauma, rari spontanei.
- Lieve: 5-40% → sanguinamenti solo post-chirurgia/trauma maggiore.
- Gene therapy (es. Roctavian/valoctocogene roxaparvovec per Em A, Hemgenix/etranacogene dezaparvovec per Em B): mira a livelli > 5-15% → fenotipo lieve/moderno.
4. Amplificazione in Diagnostica Batterica (E. coli / Shigella)
- E. coli patogeno (STEC/O157:H7, ETEC, EAEC, ecc.): dose infettante bassissima (10-100 CFU). Coltura convenzionale: lenta, bassa sensibilità se pochi batteri.
- Amplificazione acido nucleico (NAAT): Necessaria per rilevazione precoce. PCR termociclata = metodo più diffuso. LAMP isoterma = alternativa rapida campo.
- Amplificazione circolare (RCA, HDA circolare): Genera crescita esponenziale circolare → alta sensibilità.
- Risultati studio: 33 isolati E. coli, 27 varietà Shigella dysenteriae rilevati simultaneamente nello stesso campione (multiplex). Senza amplificazione: non rilevabili insieme.
Prospettive Future
- CRISPR-Cas diagnostics (SHERLOCK, DETECTR): attivazione collaterale reporter → readout laterale flusso / fluorescenza, senza termociclatore.
- Sequenziamento nanopore (ONT) real-time: identificazione specie + resistenza antibiotici + epidemiologia in ore.
- Integrazione AI/ML per interpretazione pattern amplificazione complessi.