Protocollo DNAzol: Isolamento DNA Genomico e Guida alla Sicurezza
Cos'è DNAzol
DNAzol (Molecular Research Center / Thermo Fisher) è un reagente monofasico brevettato (base guanidinio tiocianato + detergenti + agenti chelanti) per isolamento DNA genomico da tessuti animali, vegetali, cellule, sangue, virus. Vantaggio: single-step, no fenolo/cloroformio, alto rendimento, DNA ad alto peso molecolare.
Protocollo Standard DNAzol
- Omogenizzazione: Tessuto (50-100 mg) in 1 mL DNAzol. Omogenizzatore portatile (5-10 colpi) o pestello motorizzato. Tessuti molli: micropipettaggio ripetuto. Tessuti vegetali: vedi sotto.
- Centrifugazione (opzionale): 10.000-12.000 × g, 10 min, 4°C. Rimuove detriti insolubili, lipidi, polisaccaridi. Sopranatante = lisato chiaro.
- Precipitazione DNA: Aggiungere 0.5 volumi etanolo 100% (es. 500 µL etanolo per 1 mL DNAzol). Mescolare inversione. Incubare 1-3 min RT. DNA precipita (filamenti visibili).
- Recupero DNA: Centrifugare 5.000-12.000 × g, 5-10 min, 4°C. Pellet DNA (bianco, gelatinoso). Rimuovere surnatante.
- Lavaggio: 2-3 lavaggi con etanolo 75-80% (1 mL). Centrifugare 5.000 × g, 5 min. Rimuovere etanolo. Asciugare pellet all'aria 5-10 min (non essiccare eccessivamente → difficile risospensione).
- Solubilizzazione: Risospendere in H₂O bidistillata (50-200 µL) o buffer TE (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA). Incubare 10-20 min a 55-65°C con agitazione delicata. Per DNA ad alto PM, solubilizzazione lenta (overnight 4°C o 65°C 1h). Evitare vortex violento (shearing).
Sicurezza (Obbligatoria)
- DNAzol contiene guanidinio tiocianato (pericoloso: H302+H312+H332 nocivo se ingerito/contatto/inalato; H314 provoca gravi ustioni cutanee/oculari; EUH032 a contatto con acidi libera gas tossico cianuro idrogeno).
- DPI obbligatori: Camice, guanti nitrile (doppio), occhiali/schermo facciale, cappa chimica.
- Non miscelare con acidi, candeggina (ipoclorito), acidi forti.
- Smaltimento rifiuti per pericolosi (halogenated/organic waste).
- Scheda sicurezza (SDS) sempre consultata prima uso.
Ottimizzazioni per Tessuti Specifici
Tessuti Animali - Omogenizzazione Migliorata
- DNAzol Reagent + omogenizzatore portatile: 5-10 colpi sufficienti.
- Tessuti molli (cervello, fegato, milza): riducibili a frammenti fini + micropipettaggio.
Tessuti Vegetali
- Parete cellulare rigida (cellulosa, lignina) + polisaccaridi/fenoli/secondari metaboliti interferenti.
- Pre-trattamento criogenico: Polverizzare tessuto in azoto liquido (mortaio/pestello raffreddato) o ghiaccio secco + etanolo. Rompe parete cellulare, inattiva nucleasi/fenolossidasi.
- Poi omogenizzare in DNAzol. Aggiungere PVP (polivinilpirrolidone) 1-2% o β-mercaptoetanolo 0.1% nel DNAzol per legare polifenoli.
- Centrifugazione pre-precipitazione raccomandata per rimuovere polisaccaridi.
Centrifugazione Obbligatoria
Se preparazione pre-precipitazione genera eccessivo detrito/viscosità (tessuti fibrosi, piante ricche polisaccaridi, campioni grandi), centrifugazione diventa obbligatoria per ottenere lisato limpido.