Determinazione Spettrofotometrica Endpoint per Idrolisi Tripsina-Caseina

Principio

Idrolisi caseina → ↓ torbidità (schiarimento) + ↑ peptidi/aminoacidi solubili. Assorbanza a 280 nm (AA aromatici) o 440 nm (saggio colorimetrico con TCA/Folin) aumenta mentre peptidi accumulano. Più oggettivo dello schiarimento visivo.

Protocollo Ottimizzato

Materiali

• Soluzione tripsina (es. 0,1 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM CaCl₂)
• Substrato caseina (1% p/v in stesso buffer; o azocaseina per colorimetrico)
• Soluzione stop: 10% TCA o 0,5 M NaOH (denatura tripsina)
• Spettrofotometro + cuvette quarzo (1 cm percorso)
• Bagno termostatico (37°C)

Procedura

1. Preriscalda substrato ed enzima separatamente (37°C, 5 min).
2. Avvia reazione: Mescola 1 mL caseina + 0,1 mL tripsina (concentrazione finale [E] definita). Avvia timer.
3. A intervalli (0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 min), preleva 0,2 mL aliquota → 0,8 mL soluzione stop. Vortex.
4. Centrifuga 10.000g × 5 min (rimuove proteina precipitata).
5. Misura surnatante A₂₈₀ (legami peptidici) o esegui Folin-Lowry/BCA su surnatante per quantificazione peptidi totale.
6. Traccia A₂₈₀ (o μg peptidi/mL) vs tempo.

Determinazione Endpoint

• Metodo velocità iniziale (preferito): Regressione lineare punti temporali precoci (0–10% idrolisi) → V₀ (ΔA/min). Evita ambiguità endpoint.
• Metodo plateau: Tempo quando ΔA/Δt <5% velocità iniziale (reazione vicino completamento).
• Saggio tempo fisso: Confronta A a tempo definito (es. 10 min) a curva standard (idrolizzato caseina).

Vantaggi su Schiarimento Visivo

• Quantitativo, riproducibile, dati cinetici (K_m, V_max possibili).
• Insensibile a bias osservatore, illuminazione, dimensione particelle.
• Rileva idrolisi precoce prima schiarimento visibile.

Trappole Comuni

• Variabilità lotto caseina → esegui curva standard ogni saggio.
• Precipitazione TCA incompleta → scattering a 280 nm. Usa filtro 0,22 μm.
• Autolisi tripsina a 37°C → includi blank solo enzima.