Metodi per Interazioni Proteina-Proteina: Co-IP, Pull-Down, FRET, SPR, ITC, Array e Y2H

Lo studio delle interazioni proteina-proteina (PPI) richiede tecniche complementari per catturare aspetti diversi: interazioni binarie vs complesse, affinità, cinetica e contesto cellulare. Nessun singolo metodo racconta tutta la storia.

1. Co-Immunoprecipitazione (Co-IP)

Un anticorpo precipita la proteina "esca" insieme ai partner interagenti da lisato cellulare, preservando complessi nativi. Analisi a valle: Western blot o spettrometria di massa (IP-MS). Limitazioni includono interazioni indirette, dipendenza dalla qualità dell'anticorpo, e potenziale disgregazione di interazioni deboli/transitorie durante la lisi.

2. Pull-Down Assays

Un'esca taggata (GST, His, FLAG, Strep) è immobilizzata su perle e incubata con lisato o preda purificata. Lavaggi rimuovono non-leganti; eluizione e rivelazione seguono. Eccellente per validare interazioni binarie dirette; eseguita in vitro.

3. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

Donatore e accettore fluorofori su proteine interagenti. Trasferimento di energia (distanza 10–100 Å) produce segnale ratiometrico. Compatibile con cellule vive (es. coppie CFP/YFP, mTurquoise/mVenus). Quantifica prossimità e dinamiche. Richiede etichettatura e trasfezione.

4. Surface Plasmon Resonance (SPR / BIAcore)

Senza etichetta. Esca immobilizzata su chip sensore; preda fluisce sopra. Curve di legame in tempo reale forniscono cinetica (k_on, k_off), affinità (K_D) e stechiometria. Alta sensibilità; richiede purificazione proteica.

5. Isothermal Titration Calorimetry (ITC)

Misura il cambiamento di calore al legame. Fornisce direttamente ΔH, ΔS, K_D e stechiometria (n). Senza etichetta; in soluzione. Richiede quantità µg–mg di proteina; bassa produttività.

6. Protein Microarrays

Migliaia di proteine o peptidi spottati su slide. Saggiate con esca etichettata per screening ad alta produttività. Strumento di scoperta; falsi positivi/negativi richiedono validazione ortogonale.

7. Yeast Two-Hybrid (Y2H)

Sistema genetico. Esca (dominio legame DNA) + preda (dominio attivazione) fusione. Interazione attiva gene reporter (HIS3, LacZ). Screening librerie in vivo (nucleo lievito). Prone a falsi positivi (autoattivazione) e manca modifiche post-traduzionali.

Scegliere un Metodo

Obiettivo	Metodo/i Raccomandato/i
Identificazione complessi endogeni	Co-IP + MS
Validazione binaria diretta	Pull-down, SPR, ITC
Dinamiche in cellule vive	FRET/BRET
Screening ad alta produttività	Y2H, protein arrays
Termodinamica	ITC
Cinetica	SPR

La validazione ortogonale (due o più metodi) è lo standard per PPI ad alta confidenza.