Propagazione Plasmidi Ricombinanti: Guida per Ingegneria Genetica

Presenti in alcune specie di batteri e lieviti, i plasmidi sono anelli di DNA autorigeneranti, relativamente piccoli, situati fuori dal cromosoma principale della cellula. Sono molto utili in ingegneria genetica perché è relativamente facile inserire geni selezionati da altre specie nei plasmidi, trasferirli tra cellule ospiti della stessa o diversa specie, e stimolarli a replicare — o propagare — a tassi molto superiori al normale — o amplificati. I plasmidi ricombinanti sono semplicemente quelli ingegnerizzati per contenere geni da altre specie. Soprattutto con propagazione amplificata, i plasmidi ricombinanti possono esprimere più rapidamente e prontamente proteine desiderate su larga scala industriale.

Cosa ti serve

• Librerie di plasmidi e geni preesistenti, o plasmidi e geni isolati da te dai loro organismi ospiti e uniti
• Attrezzature per colture cellulari
• Agenti di amplificazione come cloruro di calcio, shock elettrico, freddo e caldo, cloramfenicolo, shock elettrico, e/o enzima Taq polimerasi

Istruzioni

1. Scegli la procedura di amplificazione che meglio si adatta al tuo specifico plasmide ricombinante e organismo ospite. Alcune procedure funzionano meglio con certi plasmidi e ospiti. Se lavori con un plasmide ricombinante nuovo, ancora sperimentale, e/o provi una specie ospite diversa, potresti dover determinare il miglior processo di amplificazione per tentativi ed errori.

2. Prova il processo chiamato trasformazione se il tuo plasmide e specie cellulare potrebbero rispondervi. Raffredda cellule e plasmidi a 0°C in soluzione di cloruro di calcio (CaCl). Alza rapidamente la temperatura a 37-43°C. Questo brusco cambiamento causa alle membrane cellulari di assorbire maggiori quantità di plasmide.

3. Invia impulsi elettrici ad alta tensione attraverso la soluzione di plasmidi e cellule se l'elettroporazione è il metodo di amplificazione desiderato. Questa tecnica aumenta la permeabilità delle membrane cellulari ai plasmidi.

4. Esponi la coltura cellulare a bassi livelli dell'antibiotico cloramfenicolo per generare fino a cento plasmidi per cellula. Questo metodo sopprime la replicazione dei cromosomi principali delle cellule ospiti inducendo replicazione incontrollata del plasmide, incluso il gene inserito.

5. Applica il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) per generare copie di plasmide a ordini di grandezza molto alti. La PCR si basa sulla polimerizzazione del DNA, la reazione chimica attraverso cui le sequenze genetiche si formano in natura. La PCR è più spesso catalizzata da un enzima termo-stabile chiamato Taq polimerasi, estratto da una specie batterica che vive in sorgenti calde.