Salute e malattia
L'enzima NADPH ossidasi è identificato come produttore di specie reattive dell'ossigeno durante processi che includono la crescita delle cellule muscolari lisce vascolari. Queste specie reattive sono collegate a una serie di malattie tra cui ipertensione, diabete, cancro e infiammazione; metodi per monitorare l'attività di questo enzima sono critici per lo sviluppo di possibili trattamenti.
La NADPH ossidasi appartiene a una famiglia di enzimi che assistono il trasferimento di elettroni tra NADPH e ossigeno. Tuttavia, la NADPH ossidasi ha l'unicà capacità di produrre specie reattive dell'ossigeno da questa reazione, rispetto ad altri membri della famiglia dove le specie reattive sono generate con altri mezzi. Un complesso proteico multimerico, la NADPH ossidasi consiste del flavocitocromo b558 legato alla membrana, che viene usato come marcatore di misurazione.
Come principale fonte di ROS, in particolare perossido di idrogeno, la NADPH ossidasi produce piccole ma costanti quantità tramite la sua isoforma espressa nei vasi sanguigni, coinvolte nei processi di segnalazione. Questa produzione costante può alla fine sopraffare il sistema antiossidante naturale, causando una perdita di composti protettivi come l'ossido nitrico, e la generazione di ROS ancora più potenti.
La chemioluminescenza consente una misurazione altamente sensibile e automatizzata dell'attività della NADPH ossidasi su una gamma di concentrazioni. Durante questo metodo, il substrato NADPH viene aggiunto a un campione di tessuto contenente NADPH ossidasi. Alla reazione, vengono generate ROS che reagiscono con il composto lucigenina per produrre un effetto chemioluminescente, che viene misurato. La luminescenza è direttamente proporzionale all'attività della NADPH ossidasi, poiché l'enzima determina la velocità della reazione.
In questo metodo, i campioni di tessuto vengono analizzati tramite citofluorimetria a flusso. Il midollo osseo viene separato dal campione usando la soluzione salina bilanciata di Hanks. Coloranti specifici e anticorpi di rilevamento vengono aggiunti al campione in tubi di polistirene. Il campione viene quindi incubato, lavato con soluzione salina bilanciata di Hanks, marcato con sonde molecolari e preparato per la citofluorimetria. Vengono preparati anche tubi di controllo per confronto e per calibrare il citofluorimetro. La macchina viene quindi avviata e le misurazioni registrate.
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