Salute e malattia
La biotinilazione usa la capacità della vitamina solubile biotina di legarsi alle proteine cellulari. La biotina si lega alla proteina streptavidina ed è quindi utile in biologia cellulare per visualizzare le proteine cellulari. La biotinilazione permette l'etichettatura sicura delle proteine rispetto a tecniche come la radioattività e non influisce sulla normale funzione cellulare. Permette ai ricercatori di studiare proteine cellulari come i recettori, consentendo una maggiore comprensione delle malattie e dei processi patologici.
Lavare le cellule in PBS ghiacciato per rimuovere contaminanti. I tamponi contenenti tris e glicina competono con la biotinilazione e dovrebbero essere evitati. Per evitare la biotinilazione di proteine interne, l'etichettatura può essere eseguita a 4 °C o in presenza di azide. Ri-sospendere le cellule in PBS e biotina solubile, sulfo-NHS-LC-biotina.
Lavare le cellule in PBS e incubare con un prodotto come sulfo-NHS-LC-biotina. Le cellule vengono poi raschiate in una piastra e lisate in un tampone contenente il detergente Triton-X 100 e preparate per la visualizzazione.
Dopo l'incubazione, le cellule vengono centrifugate in un pellet e lavate in PBS. Le cellule vengono ri-sospese in PBS e purificate con gel IgG sepharose. La proteina legata viene diluita in tampone di carico e riscaldata a 100 °C.
Le proteine diluite possono essere visualizzate usando elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) seguita da blotting con il mix proteina-enzima, streptavidina-perossidasi di rafano. I blot vengono visualizzati con una reazione chimica — chemiluminescenza — che emette luce. La specificità della biotinilazione può essere confermata con anticorpi per la proteina in studio.
Ricerca medica