Salute e malattia
Il DNA genomico fornisce il progetto per le cellule che si organizzano in organismi viventi. Contiene quattro basi azotate ripetute: adenina, guanina, citosina, timina. Ricercatori hanno determinato l'intera sequenza di basi (genoma) per molti organismi complessi inclusi umani. Molte ragioni importanti per sequenziare un genoma. Genetica medica: scoperta anomalie genetiche causando diabete, Alzheimer, cancro. Genetisti evoluzionisti: confrontano genomi specie correlate per tassonomia accurata. Protocolli genetici base nella ricerca sono gli stessi indipendentemente dallo scopo.
La ricerca genetica richiede estrazione di campione DNA puro dalle cellule. Protocollo base: disgregare e rimuovere pareti cellulari vegetali o membrane animali con enzima lisozima. Componenti non genetici (precipitati) rimossi con centrifugazione rapida mentre DNA resta in soluzione. DNA precipitato con acetato di sodio ed etanolo. Centrifugazione finale precipita e pellettizza materiale genetico puro per ricerca.
Serve copie sufficienti di regioni DNA specifiche. PCR = metodo per produrre esponenzialmente copie DNA. Protocollo richiede: DNA purificato, Taq polimerasi, basi deossinucleotidi, brevi filamenti DNA per primare area designata. Miscela in termociclatore (cambi rapidi temperatura). Riscaldamento 95°C separa DNA a doppio filamento, raffreddamento 48°C per annealing primers a basi complementari. 72°C: Taq polimerasi assembla deossinucleotidi (estensione) in nuova copia DNA.
Sequenziamento automatizzato per determinare sequenza basi esatta e confrontare DNA normale vs anomalo. Protocollo aggiunge dideossinucleotidi fluorescenti (ddNTP) a reazioni PCR normali, fermando casualmente estensione frammenti DNA. Prodotti: frammenti DNA differenti per singola base. Ogni tipo base = colore diverso. Prodotti finali caricati su sequenziatore automatizzato: separa frammenti per dimensione su polimero con corrente elettrica. All'estremità, camera digitale registra colore base e invia dati a computer per analisi.
Genotipizzazione = confronta piccoli segmenti genoma tra organismi. Obiettivo: rilevare piccole differenze dimensione frammenti PCR da cambiamenti basi normali/accidentali. Protocollo: PCR base con primer fluorescenti per rilevazione su sequenziatori automatizzati. Prodotti etichettati separati per dimensione, registrati da camera digitale a computer. Protocolli genotipizzazione per: identificazione forense, DNA fingerprinting, paternità, identificazione anomalie genetiche causanti malattie.
Settore sanitario (generale)