Kit QuikChange Mutagenesi: Protocolli e Applicazioni | Agilent

La mutagenesi QuikChange è il nome commerciale di un kit usato nella ricerca biotecnologica per indurre mutazioni genetiche o alterazioni del DNA. Agilent Technologies è l'azienda dietro il prodotto, disponibile in due versioni, QuikChange II e QuikChange Lightning. Entrambi i kit contengono una soluzione tampone, l'enzima DNA polimerasi, reagenti colorati, sequenze DNA o primer, e campioni cellulari.

Protocollo di Reazione di Sintesi del Filamento Mutante

I tecnici sintetizzano due oligonucleotidi o brevi sequenze DNA contenenti la mutazione desiderata. Poi preparano la reazione di controllo con le sequenze DNA, miscela dNTP e enzima DNA polimerasi, aggiungendo acqua distillata. Successivamente, preparano una serie di reazioni campione usando varie concentrazioni di DNA a doppio filamento (dsDNA), mantenendo costante la concentrazione di primer o oligonucleotidi, secondo le istruzioni del produttore. Mantengono i campioni a 203°F (95°C) per 30 secondi. Il campione contenente il segmento DNA numero due è anche testato sotto ciclaggio termico, una tecnica dove la temperatura cambia durante brevi periodi di tempo. Infine, i campioni vengono posti su ghiaccio per due minuti.

Protocollo di Digestione Dpn I dei Prodotti di Amplificazione

L'enzima di restrizione Dpn I taglia il DNA in siti specifici. Un microlitro di questo enzima viene aggiunto direttamente a ogni reazione di amplificazione sotto il suo standard overlay di olio minerale usando una micropipetta o punta di pipetta specializzata resistente agli aerosol. Tuttavia, un overlay di olio minerale è richiesto solo se il cicltermico, un apparato usato per amplificare segmenti DNA, non ha un assemblaggio hot-top. La reazione viene delicatamente mescolata e poi messa in un microcentrifuga per un minuto. Dopo, i campioni sono incubati a 98,6°F (37°C) per un'ora.

Protocollo di Trasformazione di Cellule XL1-Blue Supercompetenti

XL1-Blue è una linea cellulare resistente alla tetraciclina che viene fornita con i kit di mutagenesi QuikChange. Durante questo protocollo, i tecnici scongelano le cellule, precedentemente mantenute a -112°F (-80°C), su ghiaccio. Poi aggiungono un microlitro di DNA trattato con Dpn I, lo scaldano a 107,6°F (42°C) per 45 secondi e mettono la reazione su ghiaccio per due minuti. Dopo questa procedura, i tecnici aggiungono una preparazione di NZY (idrolizzato di caseina ed estratto di lievito) preriscaldata a 107,6°F (42°C) e incubano per un'ora. La preparazione viene poi messa su piastre di agar gel e incubata a 98,6°F (37°C) per 16 ore.