Clonazione del DNA: Definizione, Tipi e Applicazioni
Cos'è la clonazione del DNA
Secondo il National Human Genome Research Institute, la clonazione descrive processi per produrre copie geneticamente identiche di un'entità biologica. La clonazione del DNA (clonazione genica / tecnologia del DNA ricombinante) implica la manipolazione del DNA per generare molteplici copie di un singolo gene o frammento di DNA.
Tre tipi di clonazione
| Tipo | Descrizione | Esempio |
|---|
| Clonazione genica (DNA cloning) | Produzione di copie multiple di un gene/frammento DNA in vitro/in vivo | Clonazione gene insulina umana in E. coli per produzione insulina ricombinante |
| Clonazione riproduttiva | Creazione di organismo geneticamente identico al donatore (trasferimento nucleare cellula somatica - SCNT) | Pecora Dolly (1996), altri mammiferi. Umana: vietata universalmente |
| Clonazione terapeutica | SCNT per creare blastocisti → derivazione linee cellule staminali embrionali autologhe per medicina rigenerativa | Ricerca: cellule β pancreatiche, cardiomiociti, neuroni dopaminergici per trapianto autologo senza rigetto |
Metodologia della clonazione genica (DNA cloning)
- Isolamento gene d'interesse: PCR da DNA genomico / cDNA da mRNA / sintesi genica
- Vettore di clonazione: Plasmide, fago, cosmidio, BAC, YAC, vettore virale (AAV, lentivirus) - contiene origine replicazione, marcatore selezione (resistenza antibiotico), sito clonazione (MCS)
- Inserimento (ligazione): Enzimi di restrizione (tagliano vettore e insert agli stessi siti) → estremità coesive/compatibili → DNA ligasi (T4) → DNA ricombinante
- Trasformazione/Trasfezione: Introduzione DNA ricombinante in cellule ospite (E. coli competenti, lievito, cellule mammifere)
- Selezione e amplificazione: Coltura su terreno selettivo → colonie = cloni → screening (PCR, digestione restrizione, sequenziamento) → espansione clone positivo
- Espressione (opzionale): Se vettore espressione → produzione proteina ricombinante
Cellule ospite e amplificazione
Una singola cellula ospite non ha capacità per contenere/produrre le quantità massive di DNA/proteina necessarie. La replicazione cellulare (divisione binaria batteri) amplifica il plasmide ricombinante esponenzialmente. Fermentatori industriali (bioreattori) per produzione su larga scala.
Tecnologia del DNA Ricombinante: applicazioni biomediche
- Proteine terapeutiche ricombinanti: Insulina umana, GH, fattori coagulazione (VIII, IX), EPO, G-CSF, interferoni, anticorpi monoclonali, vaccini (epatite B, HPV)
- Terapia genica: Vettori virali (AAV, lentivirus) per consegnare geni funzionali (es. Luxturna per RPE65, Zolgensma per SMN1, Hemgenix per Fattore IX)
- Diagnostica molecolare: PCR, qPCR, NGS, CRISPR-dx (SHERLOCK, DETECTR) per patogeni, mutazioni, biopsia liquida
- Ricerca funzionale: Knockout/knockin modelli animali, CRISPR-Cas9 editing genomico, screening libreria CRISPR, organoidi
- Agricoltura/Ambiente: OGM (Bt cotton, Golden Rice), bioremediazione, biofuel
Considerazioni etiche e regolatorie
- Clonazione riproduttiva umana: vietata (Dichiarazione UNESCO 2005, Convenzione Oviedo, leggi nazionali)
- Clonazione terapeutica / ricerca embrioni: regolamentazione variabile per paese (UE: 14-giorni rule, consenso informato, no creazione embrioni solo per ricerca)
- OGM: Valutazione rischio EFSA, etichettatura, principio precauzione
- Gene editing germline: Moratoria internazionale (OMS, Accademie Nazionali) post-He Jiankui (2018)