Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC): principi e applicazioni

HPLC sta per cromatografia liquida ad alte prestazioni, una procedura standard di analisi qualitativa e quantitativa usata nei laboratori analitici. L'HPLC è affidabile e riproducibile, il che la rende la tecnica preferita per separare, identificare e quantificare molecole da miscele complesse di componenti chimici e biologici.

Quattro componenti

• La tecnica HPLC contiene quattro componenti principali. Primo, il sistema di erogazione del solvente (fase mobile), che trasporta i campioni attraverso la colonna; la polarità influisce sulla capacità di separare le molecole. La colonna cromatografica è solitamente una colonna verticale di vetro riempita con un adsorbente. Secondo, l'adsorbente (fase stazionaria, poiché non si muove) è comunemente gel di silice o allumina. Terzo, il sistema di introduzione del campione consiste in una porta di iniezione per introdurre il campione nel sistema di erogazione del solvente. Il quarto componente è il rivelatore.

Rivelatori

• Il tipo di rivelatore dipende dal tipo di campione e dalle molecole da isolare. I criteri di scelta includono selettività, rapporto segnale/rumore, limite di rivelazione, intervallo lineare, costante di tempo, deriva e volume della cella. Rivelatori comuni: ultravioletto-visibili, spettrometri di massa, indici di rifrazione, rivelatori a fluorescenza o a diffusione di luce evaporativa.

Procedura

• Accendere rivelatore, pompe (che aggiungono pressione per muovere la fase mobile attraverso la fase stazionaria) e computer che registra e stampa il cromatogramma. Scegliere i programmi appropriati per raccogliere i dati desiderati. Iniettare il campione nella porta di iniezione. Monitorare la pressione: ogni colonna ha una pressione massima da non superare, altrimenti la separazione non avviene. Stampare il cromatogramma e analizzare i risultati. Alla fine di ogni run, sciacquare la porta di iniezione per prevenire accumuli e blocchi.

Tipi

• Cromatografia a interazione idrofila: fase stazionaria polare legata e fase mobile non polare miscibile con acqua per separare molecole per polarità. Separa campioni acidi, basici e neutri in un singolo cromatogramma.
  Cromatografia a fase normale: fase stazionaria polare e fase mobile non polare non acquosa per separare isomeri strutturali (stessa formula molecolare, atomi legati diversamente).
  Cromatografia a fase inversa: il tipo HPLC più usato. Fase stazionaria non polare e fase mobile acquosa leggermente polare. Comune nell'industria farmaceutica per qualificare farmaci prima del rilascio.
  Cromatografia a esclusione dimensionale: separa molecole per dimensione e può determinare la struttura delle proteine.
  Cromatografia a scambio ionico: basata sull'attrazione tra ioni nel soluto e siti carichi legati alla fase stazionaria.

Usi

• L'HPLC è utile in varie applicazioni: analisi di materiali farmaceutici (ricerca nuovi farmaci e purificazione), analisi di fluidi biologici, pesticidi, esplosivi e altri materiali. Popolare in ricerca biomedica, biochimica e farmaceutica, è usata anche in cosmetica, alimentare, ambientale ed energetica.