Salute e malattia
Un assay è una tecnica per isolare e purificare virus e determinare i titoli virali (la concentrazione più bassa di virus che risulta in infezione). Il plaque assay, originariamente chiamato assay virologico, fu sviluppato per misurare e contare l'infettività dei batteriofagi. Secondo Biology-Online.org, fu poi applicato anche per contare virus dei mammiferi.
Una placca (plaque) è una coltura monostrato confluente di cellule. Si forma per infezione di una cellula da una singola particella virale, secondo Biology-Online.org. Una volta infettata, la cellula replica il virus e alla fine muore. Le nuove particelle virali replicate si diffondono, infettano e uccidono le cellule vicine.
Nel plaque assay, la coltura viene prima colorata con un colorante specifico. Questo colora solo le cellule vitali (vive), secondo Biology-Online.org. Di conseguenza, le cellule morte appaiono non colorate nella coltura, sullo sfondo colorato. Attualmente, il plaque assay è applicato per rilevare cellule che producono anticorpi che distruggono gli eritrociti per emolisi.
Gli eritrociti (globuli rossi) contengono emoglobina e trasportano ossigeno e anidride carbonica nel sangue, da polmoni e tessuti. L'emolisi avviene quando gli eritrociti si rompono e rilasciano emoglobina, secondo Biology-Online.org. Di conseguenza, nel plaque assay, la base è una placca chiara e indica che i globuli rossi sono stati emolisiti dagli anticorpi.
Diluizioni decimali di uno stock virale sono preparate prima del plaque assay e aliquote di 0,1 mL sono poste sui monostrati cellulari. Questa miscela è incubata per dare tempo al virus di attaccare le cellule. I monostrati sono coperti da un mezzo nutritivo contenente una sostanza (solitamente agar), secondo "Detecting Viruses: A Plaque Assay" di Vincent Racaniello. Il mezzo forma un gel e dopo l'incubazione, le cellule originariamente infette rilasciano la progenie virale. Il gel limita la diffusione del virus alle cellule circostanti, e di conseguenza la particella infettiva produce una zona circolare chiamata placca. Con il tempo, la placca cresce a dimensioni visibili a occhio nudo e coloranti sono usati per migliorare la visualizzazione.
Il titolo virale è calcolato in unità formanti placca (PFU) per millilitro. Vengono contate e, per minimizzare l'errore, si contano solo piastre con 10-100 placche. Secondo "Detecting Viruses: A Plaque Assay", per ogni 100 placche contate lo stesso titolo varierà di ±10%. Quindi l'errore stimato di un plaque assay è circa il 10%, se eseguito correttamente.
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