Diluizione degli Anticorpi per IHC: Guida Completa per Risultati Ottimali
Introduzione all'Immunoistochimica (IHC)
L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica specialistica utilizzata dagli scienziati per visualizzare le cellule all'interno di tessuti posti su un vetrino e colorati con un anticorpo appropriato che riconosce una proteina unica per la cellula o il tessuto in esame. Le diluizioni degli anticorpi (titolazioni) devono essere eseguite utilizzando le condizioni sperimentali specificate nel proprio protocollo, non quelle del produttore dell'anticorpo, poiché le due potrebbero non essere identiche.
Materiale Necessario
- Cellule da colorare
- Anticorpo
- Buffer di diluizione ("diluente")
- Pipette e puntali
- Tubetti microfuge
- Carta stagnola
- Marcatori da laboratorio ed etichette per tubetti
- Ghiaccio
- Scatola per vetrini protetta dalla luce
Procedura Passo per Passo
- Verificare e preparare l'anticorpo. Controllare che l'anticorpo sia stato prodotto nell'ospite corretto e reagisca con la versione esatta della proteina (isoforma o variante di splicing) in esame. Utilizzando una pipetta, prelevare accuratamente una porzione di 10 microlitri ed etichettarla come "stock personale". Se sono disponibili solo volumi molto piccoli di anticorpo, saltare questo passaggio. Mantenere uno stock personale di anticorpo è pratica routine in tutti i laboratori in quanto previene la contaminazione crociata dello stock originale. Dispensare in un tubetto microfuge protetto dalla luce, o in un tubetto normale avvolto in carta stagnola per proteggere dalla luce diretta. Conservare il tubetto su ghiaccio, preferibilmente in un contenitore termico con coperchio ermetico, per minimizzare l'esposizione alla luce che può distruggere l'anticorpo. Annotare sul tubetto la concentrazione dello stock originale (es. 100 Unità per millilitro, 1 milligrammo per microlitro, ecc.), il nome dell'anticorpo e l'eventuale buffer in cui è diluito (es. siero, soluzione salina, acqua).
- Preparare il buffer di diluizione (diluente per anticorpi). Verificare la compatibilità con l'anticorpo e la procedura di immunoistochimica utilizzata: non deve oscurare alcuna fluorescenza o inibire il successivo marcaggio con anticorpo secondario. Preparare una diluizione standard per IHC (anche buffer di blocco) mescolando PBS 1X con Triton-X100 1%, siero di vitello fetale 10% e azide di sodio 0,2%.
- Titolare l'anticorpo. Con la concentrazione data dell'anticorpo nello stock personale (espressa in unità di concentrazione come microgrammo per microlitro), determinare il volume di anticorpo necessario per ottenere 10 microgrammi di anticorpo. Impostare una serie di diluizioni pipettando un volume equivalente a 2 microgrammi di anticorpo (es. X microlitri) in 100 microlitri di diluente e mescolare accuratamente pipettando su e giù. Da questa diluizione iniziale, prelevare gli stessi X microlitri e aggiungerli a successivi 100 microlitri di diluente. Ripetere fino a ottenere 8-10 diluizioni (una serie). L'ultimo tubetto avrà quindi la concentrazione più bassa e sarà la concentrazione "saturante" che genererà il livello di segnale più alto durante l'esperimento. Tuttavia, la concentrazione ideale sarà leggermente più concentrata di questa, per evitare che un segnale eccessivo causi errori di fondo. Etichettare correttamente i tubetti con le nuove concentrazioni diluite.
Note Importanti
La titolazione corretta è essenziale per ottenere risultati riproducibili e specifici. Un anticorpo troppo concentrato può causare inespecificità e alto background, mentre uno troppo diluito può dare segnali deboli o falsi negativi.