Test degli acidi nucleici: rilevamento rapido per diagnosi più veloce

Il test degli acidi nucleici è eseguito in diagnostica medica per rilevare patogeni, come virus o batteri. Questi test sono molto più rapidi e permettono al medico di iniziare il trattamento per un paziente che altrimenti avrebbe dovuto attendere la conferma dell'infezione usando test basati su anticorpi più lunghi e noiosi. Il processo è anche noto come test di amplificazione degli acidi nucleici, e include un metodo noto come "amplificazione a trascrittasi inversa" mediante reazione a catena della polimerasi. Essendo una procedura scientifica altamente specializzata, sono necessarie conoscenze avanzate ed esperienza in tecniche e teoria di biologia molecolare.

Cose che vi serviranno

• Tubi PCR
• Ciclatore PCR
• Pipette e puntali con filtro
• Guanti
• Cellule
• Trizol o altro reagente per estrazione RNA
• Buffer PCR
• Taq polimerasi
• Primer RT-PCR a concentrazione 1 mg/ml
• Acqua senza RNasi
• dNTP
• MgCl2
• Primer casuali a concentrazione 1,8 mg/ml
• SuperScript II trascrittasi inversa

Istruzioni

1. Elaborazione e preparazione dell'RNA

   • Raccogliete le cellule con un reagente per estrazione RNA, come Trizol. 1 ml è sufficiente per raccogliere cellule da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Le cellule vengono pipettate su e giù accuratamente per omogeneizzarle e poi si esegue la procedura di estrazione come da scheda tecnica Trizol. In breve: estrazione con cloroformio, centrifugazione per separare fasi DNA, proteine e RNA. Recuperare solo la fase RNA incolore e precipitare con isopropanolo. Dopo incubazione, centrifugare e pulire il pellet con diversi lavaggi con etanolo. Risospendere il pellet in acqua senza RNasi.

   • Per la trascrizione inversa, denaturare esattamente 5 microgrammi di RNA a 65°C in un volume di 10 µl di acqua senza RNasi, poi mettere rapidamente su ghiaccio. Per ogni reazione, combinare 10 µl RNA, 3 µl buffer PCR 10X, 2,5 µl dNTP 10 mM, 6 µl MgCl2 25 mM, 1 µl primer casuali 1,8 mg/ml, 0,5 µl enzima SuperScript II. Completare con 17 µl acqua senza RNasi. Incubare a temperatura ambiente 10 minuti, poi a 42°C per un'ora per produrre cDNA, poi denaturare a 95°C e raffreddare rapidamente su ghiaccio per fermare la reazione.

   • Per una reazione a catena della polimerasi, preparare nuovamente una miscela in tubi 0,5 ml combinando 6 µl cDNA dalla reazione di trascrizione inversa, 1,5 µl buffer PCR 10X, 0,2 µl Taq polimerasi, 0,5 µl primer reverse e 0,5 µl primer forward, completare con 10,3 µl acqua senza RNasi. Per eseguire le reazioni, impostare un termociclatore (macchina per PCR) per 30 cicli: 95°C per 0,5 min (denaturazione), 60°C per 45 sec (annealing), 72°C per 1 min (estensione).