Infezione da Retrovirus: Protocolli e Meccanismi

Contenenti un genoma RNA incapsulato in un capsidio e un involucro lipidico, i retrovirus contengono catene polipeptidiche che aiutano a legarli ai recettori nelle membrane delle cellule ospiti che infettano. Mentre l'informazione ereditaria della maggior parte delle cellule è codificata nel DNA, quella dei retrovirus è contenuta nell'RNA; i retrovirus portano anche l'enzima trascrittasi inversa, permettendo loro di aderire al DNA dell'ospite. Certi protocolli sono seguiti dai laboratori nell'infezione intenzionale della cellula DNA con questi virus.

Preparazione del Laboratorio

Certi strumenti e forniture di laboratorio sono necessari per aiutare il processo di infezione retrovirale. L'attrezzatura include: 1 aiuto pipetta, 1 pipetta-man, 1 cappa a flusso laminare, incubatori a 37 °C e 32 °C, e una centrifuga Eppendorf. I materiali includono piastre per colture tessutali, una pipetta Pasteur monouso, supernatante retrovirale qualificato, polibrene sterilizzato per filtrazione e solfato di protamina sterilizzato per filtrazione.

Preparazione della Cellula per l'Infezione

Prima dell'infezione, le cellule bersaglio devono essere divise in una piastra per coltura tessutale e incubate durante la notte in un incubatore a 37 °C con 5% CO2. Lo scopo del periodo di incubazione è creare cellule confluenti al 50%. Preparare le cellule in anticipo è necessario per assicurare che le cellule siano ottimizzate per il processo di infezione. Il Nolan Lab della Stanford University raccomanda che l'infezione cellulare inizi sempre infettando le cellule NIH 3T3 per aiutare a ottimizzare i risultati del test.

Infezione delle Cellule

Dopo il periodo di incubazione, i ricercatori dovrebbero assicurarsi che le cellule siano sia sane che della giusta confluenza. Usando la cappa a flusso laminare, il materiale cellulare viene aspirato e un supernatante virale viene applicato alle cellule. Una volta applicato, la piastra dovrebbe essere delicatamente dondolata avanti e indietro per assicurare una distribuzione uniforme. Le cellule dovrebbero poi essere spin-inoculate ponendole nella centrifuga Eppendorf e facendole girare a 2.500 rpm per novanta minuti a una temperatura di 30 °C. Successivamente, le cellule dovrebbero essere incubate a 32 °C per uno o due giorni. Il virus viene poi sostituito con le cellule estratte e poste nell'incubatore per essere analizzate da tre a sette giorni dopo l'infezione iniziale.