Purificazione della Proteina Legante il Maltosio (MBP): Protocolli e Tecniche

L'MBP o proteina legante il maltosio si trova nel batterio Escherichia coli, che fa parte della flora intestinale di umani e animali. La purificazione dell'MBP implica una serie di procedure mirate a separare i costituenti della proteina. In biologia molecolare, la purificazione dell'MBP è un processo vitale per lo studio della struttura e funzione di questa proteina. I protocolli di purificazione MBP includono purificazione proteine fuse MBP, purificazione MBP-fusione su piccola scala e purificazione tag di fusione proteina legante maltosio.

Purificazione Proteine Fuse MBP

Durante questo protocollo, i tecnici lavano 20 ml di resina polimerica di amilosio con una soluzione Tris a pH 7,4, cloruro di sodio, mercaptoetanolo (ME) e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), secondo Protocols Online. I campioni cellulari vengono aggiunti, centrifugati e analizzati su elettroforesi su gel. I campioni vengono anche analizzati in un cromatografo, dove i tecnici eluono o osservano i costituenti della soluzione mentre passa attraverso la colonna di cromatografia.

Purificazione Proteina MBP-fusione su Piccola Scala

Secondo l'Università Ebraica di Gerusalemme, i biologi usano il reagente isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG), centrifugano la coltura cellulare per 10 min a 8.000 giri/min a 4 °C (39,2 °F). Successivamente, rimuovono il liquido surnatante e mescolano tampone PBS freddo al campione, che viene diviso in diverse provette e centrifugato di nuovo. I campioni vengono poi conservati a -80 °C (-112 °F) per analisi successive.

Purificazione Tag di Fusione Proteina Legante Maltosio

I tag di affinità sono molecole ingegnerizzate geneticamente impiegate in biologia molecolare per rilevare e purificare proteine. Questo protocollo è un complesso insieme di procedure divise in tre fasi, che includono la costruzione di un marcatore proteico poliistidina (HisMBP); un esperimento pilota per valutare la solubilità della proteina; e la purificazione su larga scala delle molecole MBP, secondo Nature Protocols. Oltre ai campioni E. coli, i tecnici usano ampicillina, kanamicina, IPTG, anidrotetraciclina, glucosio monoidrato, tampone lisi cellulare, polimerasi DNA, primer PCR, Tris-acetato-EDTA e bromuro di etidio.