Misurazione del NADH: Metodi e Importanza nel Metabolismo Cellulare

NAD e NADH sono entrambi nucleotidi piridinici coinvolti nel metabolismo. NADH e NAD sono co-enzimi presenti nei mitocondri, le centrali energetiche della cellula. Sia NAD che NADH sono coinvolti in reazioni cellulari come la respirazione e la fotosintesi dove vengono generati energia e idrogeno. NAD e NADH alimentano reazioni biochimiche che richiedono una serie di enzimi per produrre ATP, la principale fonte di energia nelle cellule.

Materiale Necessario

• Cellule o tessuto in studio
• Kit per dosaggio NADH
• Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
• Ghiaccio secco
• Blocco riscaldante
• Piastra a 96 pozzetti
• Centrifuga
• Provette etichettate
• Lettore di piastre
• Vortex
• Concentrazione nota di NADH

Istruzioni

Dosaggio

1. Lavare le cellule o il tessuto in studio con PBS freddo. Estrarre le cellule o rompere il tessuto in tampone di estrazione ponendo la miscela su ghiaccio secco per 20 minuti e poi a temperatura ambiente per 10 minuti. Ripetere.

2. Vortex per 10 secondi. Centrifugare per 5 minuti per pelletizzare detriti cellulari o tissutali. Rimuovere il surnatante, la fase liquida, e porre il liquido in una provetta pulita.

3. Filtrare il surnatante attraverso un filtro specializzato per rimuovere gli enzimi che degradano il NADH.

4. Rimuovere 200 microlitri, porre in una provetta pulita e riscaldare a 60 °C in un blocco riscaldante per 30 minuti per denaturare il NAD. Raffreddare e centrifugare e rimuovere la fase liquida. Trasferire 50 microlitri in una piastra a 96 pozzetti; ogni campione dovrebbe essere in duplicato o triplicato. Per determinare il NAD totale (NADt), non riscaldare.

5. Preparare e aggiungere il mix di ciclizzazione alla piastra a 96 pozzetti. Mescolare e incubare per 5 minuti. Aggiungere 10 microlitri di sviluppatore e lasciare incubare a temperatura ambiente fino a 4 ore. Aggiungere soluzione di arresto. Leggere il cambiamento di colore su un lettore di piastre o fluorimetro a seconda del kit.

Curva Standard e Calcolo

6. Preparare una curva standard prendendo una concentrazione nota di NADH e diluendola in tampone di estrazione. Diluire in diverse concentrazioni, assicurandosi che il volume finale rimanga lo stesso dei campioni di test. Piastrare sulla stessa piastra a 96 pozzetti dei campioni di test. Leggere la densità ottica.

7. Tracciare il grafico della curva standard con la concentrazione sull'asse X e la densità ottica sull'asse Y. Prendere la media di ogni campione di test e leggere la concentrazione dal grafico della curva standard.

8. Calcolare il rapporto NAD/NADH sottraendo il NAD totale (NADt) dal NADH e dividendo poi per NADH.