Western Blotting: Guida Completa per Identificazione Proteine
Principio
Western blot: tecnica nota per identificare proteine specifiche isolate da tessuto. Proteine separate per carica e peso su gel SDS-poliacrilammide, trasferite su membrana nitrocellulosa. Anticorpi marcati legano proteina bersaglio → visualizzazione su pellicola raggi X o colorazione proteina-specifica. Risultato: bande scure = presenza proteina identificata. Articolo focalizzato su metodologia base per laboratorio qualificato ricerca proteica complessa.
Materiale Necessario
- Gel SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) con proteine separate
- Membrana nitrocellulosa
- Acqua distillata
- Buffer trasferimento (30g Tris, 144g Glicina, 200ml metanolo in 1L acqua)
- Carta filtro Whatman 3mm
- Spugna da laboratorio
- Camera trasferimento Western blot
- Alimentatore da laboratorio
- Frigo da laboratorio
- Agitatore da laboratorio
- Soluzione TBS (24,2g Tris Base, 80g NaCl in 1L acqua)
- Soluzione bloccante (5% latte scremato in polvere in TBS)
- Soluzione anticorpo primario
- Soluzione coniugato anticorpo marcato
- Soluzione substrato fosfatasi alcalina con nitro blue tetrazolium
- PBS (fosfato buffer salino)
- Gel-imager box
1. Trasferimento Proteine su Membrana Nitrocellulosa
- Prepara membrana: Immersa acqua distillata 2 min, poi in buffer trasferimento 5 min.
- Assembla "sandwich": Spugna/carta filtro/SDS-PAGE/membrana nitrocellulosa/carta filtro/spugna. Allineamento: membrana verso anodo, gel verso catodo dentro camera.
- Aggiungi buffer: Sandwich sommerso. Camera in frigo a 4°C.
- Imposta alimentatore: Direzione trasferimento verso anodo (cavo rosso). Proteine grandi migrano prima. Alimentatore controlla velocità. 30V, 40mA per trasferimento overnight.
- Smonta alimentatore: Dopo trasferimento. Non toccare buffer né rimuovere sandwich con alimentatore collegato.
- Incuba membrana in soluzione bloccante 2h: Proteine bloccante assorbono dove no proteine target. Impedisce legame anticorpi aspecifico.
2. Legame Anticorpo
- Incuba con anticorpo primario + agitatore: Membrana completamente sommersa ≥1h (accettabile overnight).
- Lavaggi: 4 lavaggi 10 min con TBS per rimuovere anticorpo non legato.
- Incuba con coniugato anticorpo marcato + agitatore: ≥1h. Coniugato legato a fosfatasi alcalina. Mix enzima-anticorpo riconosce e lega primo anticorpo.
3. Rilevazione Proteina
- Risciacquo PBS 10 min ×4: Rimuove resto coniugato.
- Incuba in substrato fosfatasi alcalina finché appaiono bande: Colorante lega complesso anticorpo-antigene-proteina → banda scura. Processo immediato o fino a 30 min.
- Avvolgi membrana in cellophane e poni su gel-imager: Visualizza risultati. Gel-imager fotografa bande su membrana Western blot.