Separazione plasma sanguigno: confronto tecniche centrifugazione e filtrazione
Separare il plasma — la componente fluida acellulare del sangue — dagli elementi cellulari come globuli rossi, bianchi e piastrine è un passo fondamentale in chimica clinica, test coagulazione e biobanking. Due principali metodi fisici dominano questo processo: centrifugazione e filtrazione.
1. Centrifugazione: Lo standard di riferimento
Principio
La centrifugazione sfrutta la sedimentazione sotto forza centrifuga (espressa come forza centrifuga relativa, FCR, o g-force). Secondo la legge di Stokes, particelle più dense migrano verso l'esterno più rapidamente, formando strati distinti basati su densità.
Protocollo standard
- Raccogli sangue intero in tubetto anticoagulante appropriato (citrato per studi coagulazione, EDTA o eparina per chimica clinica).
- Bilancia tubetti accuratamente nel rotore.
- Centrifuga a impostazioni tipiche: 1.500-3.000 ×g per 10-15 minuti a 20-25°C. G-force maggiori o durate più lunghe producono plasma privo piastrine.
- Emergono tre strati: globuli rossi (fondo), sottile buffy coat (globuli bianchi e piastrine), e plasma (superficie, ~55% volume).
- Aspira plasma con pipetta, evitando buffy coat.
Variabili critiche
- FCR, non RPM: FCR = 1,118 × 10⁻⁵ × r (cm) × RPM². Standardizza protocolli per FCR.
- Temperatura: 20-25°C per lavoro routinario; 4°C per analiti labili (es. lattato, ammoniaca).
- Tempo: Centrifugazione insufficiente lascia contaminazione piastrinica, causando pseudoiperkaliemia e conta piastrinica falsamente bassa.
- Protocollo doppio-spin essenziale per plasma privo piastrine, specialmente per saggi fattori coagulazione.
2. Filtrazione: Tubetti separazione plasma e dispositivi membrana
Principio
La filtrazione si basa su esclusione dimensionale: una membrana porosa (dimensione pori ~0,2-0,5 µm) permette passaggio plasma trattenendo componenti cellulari.
Tipi
- Tubetti integrati (es. BD PST™, Litio Eparina PST): Combinano barriera gel con filtro poliestere. Durante centrifugazione, gel forma barriera e filtro separa plasma, eliminando pipettaggio manuale.
- Filtri standalone (es. Pall, Whatman): Operano per gravità o vuoto. Utili per piccoli volumi, test point-of-care, o quando centrifuga non disponibile.
Vantaggi
- Workflow più veloce senza passo separazione manuale.
- Ridotto rischio emolisi perché pipettaggio evitato.
- Sistema chiuso aumenta sicurezza biohazard.
Limitazioni
- Adsorbimento proteine su membrana può abbassare concentrazioni misurate albumina, immunoglobuline, altre proteine.
- Attivazione piastrinica e rilascio durante filtrazione può alterare fattori coagulazione, serotonina, livelli trombossano.
- Non adatto per test funzione piastrinica, certi saggi coagulazione, situazioni richiedente accuratezza proteica assoluta.
- Volume-limitato (tipicamente 1-5 mL).
Confronto e guida selezione
| Parametro | Centrifugazione | Filtrazione (PST) |
|---|
| Purezza plasma | Alta (operatore-dipendente) | Consistente, ma con perdita proteine |
| Contaminazione piastrinica | Controllabile via doppio-spin | Bassa (filtro trattiene piastrine) |
| Idoneità analiti | Tutti i test | Chimica routinaria; evita coagulazione, proteine, saggi piastrinici |
| Throughput | Alto (capacità rotore) | Base per-tubetto |
| Attrezzatura | Centrifuga richiesta | Centrifuga (per PST) o vuoto/gravità |
| Costo per campione | Più basso | Più alto (tubetti specializzati) |
Essenziali qualità
- Riempi tubetti al volume dichiarato; rapporto anticoagulante-sangue è critico.
- Mescola delicatamente invertendo 8-10 volte immediatamente dopo raccolta.
- Processa entro tempistiche linee guida (es. tubetti citrato <4 ore; tubetti EDTA <24 ore a temperatura ambiente).
- Etichetta chiaramente: plasma (anticoagulato) vs siero (coagulato, nessun anticoagulante).
La centrifugazione rimane il metodo di riferimento per massima fedeltà analitica. I tubetti filtrazione offrono convenienza per chimica routinaria ad alto volume — validare contro centrifugazione per ogni saggio prima adozione.