Conteggio Eritrociti e Leucociti con Emocitometro: Perché la Diluizione Conta e Come Farla Correttamente
Il conteggio accurato delle cellule ematiche usando un emocitometro richiede una diluizione appropriata — mai usare sangue concentrato. Campioni concentrati causano sovrapposizione cellulare, aggregazione, ed errori di conteggio. Rapporti di diluizione standard assicurano che le cellule siano distribuite uniformemente nella camera di conteggio.
Conteggio Eritrociti (RBC)
Diluizione
- Diluizione standard: 1:200 (1 parte sangue + 199 parti diluente)
- Diluente: Soluzione di Hayem, soluzione di Gower, o soluzione salina isotonica con fissativo
- Mescolare accuratamente dopo diluizione
Caricamento e Conteggio
- Posizionare coprioggetto su emocitometro (camera Neubauer o Neubauer migliorata).
- Applicare campione diluito al bordo del coprioggetto — azione capillare riempie camera.
- Attendere deposito cellule 1-2 minuti.
- Al microscopio (obiettivo 10×), contare eritrociti nei 5 grandi quadrati d'angolo (ciascuno 1 mm², suddiviso in 16 quadrati piccoli).
- Applicare regole conteggio: includere cellule che toccano linee superiore/sinistra; escludere quelle che toccano linee inferiore/destra.
Calcolo
Conteggio RBC (cellule/µL) = (Totale cellule contate in 5 quadrati) × 10.000
Derivazione: fattore diluizione 200 × profondità camera 0,1 mm × area 1 mm² × 5 quadrati = 10.000
Conteggio Leucociti (WBC)
Diluizione
- Diluizione standard: 1:20 (1 parte sangue + 19 parti diluente)
- Diluente: Soluzione di Turk (acido acetico + violetto di genziana) lisa eritrociti e colora nuclei leucociti
Caricamento e Conteggio
- Caricare campione diluito in emocitometro come sopra.
- Contare leucociti nei 4 grandi quadrati d'angolo (1 mm² ciascuno).
- Differenziare tipi cellulari se esecuzione differenziale manuale (neutrofili, linfociti, monociti, eosinofili, basofili).
Calcolo
Conteggio WBC (cellule/µL) = (Totale cellule contate in 4 quadrati) × 50
Derivazione: fattore diluizione 20 × profondità camera 0,1 mm × area 1 mm² × 4 quadrati = 50
Punti Critici di Qualità
- Usare emocitometro e coprioggetto puliti, asciutti — niente detriti o graffi.
- Assicurare mescolamento appropriato prima caricamento; evitare bolle.
- Contare almeno 100 cellule per tipo per affidabilità statistica.
- Seguire istruzioni produttore e SOP laboratorio.
- Analizzatori automatizzati hanno largamente sostituito conteggi manuali ma emocitometria rimane metodo riferimento per validazione.