Lisi globuli rossi con cloruro ammonio: meccanismo osmotico e uso laboratoristico

Il cloruro d'ammonio (NH₄Cl) lisia i globuli rossi (GR) via lisi osmotica, sfruttando l'unicità permeabilità membrana GR a NH₃/NH₄⁺.

Meccanismo

1. NH₄Cl dissocia: NH₄⁺ + Cl⁻.
2. NH₃ (non carico) diffonde RAPIDAMENTE DENTRO GR (alta permeabilità).
3. Dentro GR (pH ~7.2): NH₃ + H⁺ → NH₄⁺ (intrappolato).
4. [NH₄⁺] intracellulare sale → ↑ osmolarità → afflusso acqua → rigonfiamento → rottura.
5. Cl⁻ segue o entra via scambiatore anioni (AE1/Banda 3).

Perché è selettivo per GR

• GR mancano mitocondri → nessun ciclo urea per detossificare NH₄⁺.
• Alta permeabilità NH₃ (canali AQP1, RhAG).
• Cellule nucleate (GB) metabolizzano NH₄⁺ via glutammina sintetasi; resistono lisi.

Protocollo standard (Buffer lisi ACK)

• Composizione: 150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA, pH 7.2-7.4.
• Concentrazione: ~0.8% NH₄Cl (8 g/L) – vicino al 0.9% citato.
• Procedura: aggiungi 1-5 mL buffer per 1 mL sangue; incuba 2-5 min a RT; centrifuga; lava.
• Temperatura: RT ottimale; 4°C rallenta lisi.

Applicazioni

• Lisi GR in sangue intero per analisi GB (citometria flusso, estrazione DNA/RNA).
• Tipizzazione sanguigna (rimuovi interferenza GR).
• Isolamento cellule mononucleate sangue periferico (PBMC) (dopo Ficoll).
• Processamento midollo osseo / milza.

Limitazioni e alternative

• Può danneggiare GB se prolungato (>10 min) o alta concentrazione.
• Non per saggi funzionali che richiedono membrane intatte.
• Alternative: acqua ipotonica (più veloce, più dura), buffer lisi GR commerciali (es. BD Pharm Lyse, eBioscience).

Sicurezza

• NH₄Cl è irritante; usa guanti, occhiali.
• Smaltisci per protocollo rifiuti chimici istituzionale.