Metodi di citometria a flusso: guida completa all'analisi cellulare

La citometria a flusso si basa sul principio della focalizzazione idrodinamica, usando una sorgente di eccitazione luminosa (laser) per misurare e analizzare le caratteristiche fisiche di singole particelle. È prevalentemente applicata all'analisi cellulare: dimensioni, granularità, intensità di fluorescenza. I metodi di rilevamento essenziali includono luce diffusa in avanti, luce diffusa laterale e fluorescenza.

Citometro a flusso

• Comprende sistemi fluidico, ottico ed elettronico. Il sistema fluidico trasporta il campione al fascio laser. Il sistema ottico contiene laser e filtri che illuminano i campioni e dirigono i segnali luminosi ai rivelatori. La luce rilevata è convertita in segnali elettronici dal sistema elettronico per l'elaborazione al computer.

Luce diffusa in avanti (Forward-Scattered Light)

• La luce diffratta in direzione avanti è rilevata a circa 20° dall'asse del fascio laser da un fotodiodo detto canale forward-scatter (FSC). È direttamente proporzionale alla superficie della particella, indicando la dimensione cellulare e distinguendo cellule vive da morte. Per queste caratteristiche, FSC è usato in immunofenotipizzazione come trigger per l'elaborazione del segnale.

Luce diffusa laterale (Side-Scattered Light)

• La luce rifratta a qualsiasi interfaccia cellulare è misurata a circa 90° dall'asse del laser dal canale side-scatter (SSC), poi reindirizzata al rivelatore da uno splitter. Corrisponde approssimativamente alla granularità o complessità interna della cellula, determinando il contenuto granulare. La combinazione di luce diffusa laterale e avanti distingue diversi tipi cellulari.

Fluorescenza

• Fornisce informazioni quantitative e qualitative su molecole intracellulari (citochine, DNA) e recettori di superficie, usando etichette fluorocromatiche e misurando a diverse lunghezze d'onda. Ogni fluorocromo ha un intervallo di lunghezza d'onda specifico per l'assorbimento (spettro di assorbimento). La fluorescenza avviene quando un elettrone eccitato emette un fotone dopo l'assorbimento luminoso.