Salute e malattia
L'ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) è una tecnica fondamentale sia nella diagnostica clinica che nella ricerca biologica per quantificare proteine specifiche. Sfruttando la specificità degli anticorpi e una lettura colorimetrica o chemiluminescente, l'ELISA traduce l'abbondanza proteica in un segnale misurabile.
Seminare le cellule nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti a una densità che produce 100 µL di mezzo di crescita per pozzetto. Lasciare che le cellule aderiscano durante la notte. Per studi che coinvolgono risposte cellulari a stimoli esterni, privare le cellule di siero per 24 ore prima di aggiungere il fattore di interesse.
Rimuovere il mezzo e fissare le cellule con formaldeide al 3% o metanolo. Per permettere l'accesso degli anticorpi, permeabilizzare la membrana con Triton X-100 allo 0,1% a meno che la fissazione con metanolo non sia già stata eseguita. Bloccare i siti aspecifici con siero fetale bovino al 10% diluito in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Dopo il blocco, aggiungere l'anticorpo primario e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.
Lavare le cellule tre volte con PBS, quindi applicare un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP). Incubare per 60 minuti, lavare di nuovo e aggiungere un substrato chemiluminescente. Catturare la luce emessa con un lettore di piastre o sistema di imaging per quantificare i livelli proteici.
Ricerca medica