Salute e malattia
Preparazione costrutti. Generare o preparare costrutti di fusione di ogni proteina d'interesse, ciascuna legata a una molecola a trasmissione di fluorescenza come GFP (proteina fluorescente verde), rodamina o BODIPY (boro-dipirrometene).
Lunghezze d'onda. Determinare lunghezze d'onda di assorbimento ed emissione di ogni componente fluorescente e dell'assay complessivo. (Es.: se l'assay misura trasferimento GFP→rodamina, l'assorbimento in ingresso è quello del GFP (488 nm) e l'emissione rilevata è quella della rodamina (595 nm)).
Buffer di reazione. Creare buffer appropriato per l'esperimento, in base alle proprietà biochimiche delle proteine d'interesse. Spesso si usa buffer TRIS con cloruro di calcio e 0,05% Tween-20. Concentrazioni e componenti specifici si trovano in letteratura su reazioni e condizioni simili.
Miscelazione e incubazione. Mescolare le due proteine reporter-coniugate a varie concentrazioni nel buffer di reazione, aliquotare 50-200 µl per pozzetto. Aggiungere enzima di coniugazione (es. sortasi) se appropriato. Per assay end-point: incubare a temperatura ambiente (o temperatura ottimale dell'enzima) per un tempo determinato, poi leggere al lettore. Per assay cinetico: procedere direttamente alla lettura (vedi sotto).
Lettura e analisi. Inserire la piastra nel lettore. Creare nuova pagina esperimento e accedere al menu impostazioni. Inserire lunghezze d'onda di assorbimento (eccitazione) ed emissione corrette, selezionare i pozzetti da leggere. Per esperimento cinetico: impostare durata e intervallo letture (es. ogni 10 min). Avviare lettura. Analizzare dati con funzioni grafiche di Excel o altri software (es. GraphPad).
Settore sanitario (generale)