Salute e malattia
I ricercatori genetici hanno unito gli sforzi per determinare l'intera sequenza genomica umana: 3 miliardi di basi (non 9 miliardi). Il genoma è il contenuto di DNA in ogni cellula umana, costituito da basi azotate ripetute: "A", "G", "C", "T". La ricerca genetica continua a cercare variazioni tra genomi umani e tra specie per studi evolutivi. Gli studi medico-genetici mirano a localizzare anomalie o variazioni genetiche causa di malattie. Il genotipaggio è un metodo per determinare la variazione genetica senza sequenziare l'intero genoma. I ricercatori isolano piccole regioni genomiche per cercare differenze di dimensione, dovute a diverso numero di basi azotate. Differenze nel numero di basi possono derivare da anomalie genetiche che causano diabete, Alzheimer, cancro. Gli strumenti per applicazioni di genotipaggio si sono evoluti per determinare rapidamente e accuratamente il genotipo individuale.
L'evoluzione della tecnologia genetica ha origine nello sviluppo della PCR. Questo metodo permette di amplificare (copiare) piccole regioni genomiche in poche ore. La regione d'interesse è definita dall'aggiunta di brevi molecole di DNA — primer complementari all'inizio e alla fine della regione target.
La PCR è diventata strumento inestimabile in genetica. Amplificare la stessa regione in individui diversi fornisce un metodo di confronto. L'identificazione forense usa attualmente 15 regioni separate. Una regione può coincidere in persone diverse; ma ness due individui dovrebbero coincidere in tutte e 15.
La PCR amplifica regioni specifiche di DNA, ma non confronta le dimensioni reali dei frammenti. I prodotti PCR vengono separati per dimensione usando un materiale gelatinoso, l'agarosio. Frammenti più piccoli migrano più velocemente nell'agarosio in risposta a corrente elettrica: "elettroforesi su gel di agarosio".
Dopo PCR, i frammenti vengono caricati sul gel e migrano sotto corrente. Il bromuro di etidio rende i frammenti visibili sotto UV. L'elettroforesi su agarosio permette verifica rapida del successo PCR e stima approssimativa della dimensione dei frammenti. Svantaggio: i frammenti devono differire sostanzialmente in dimensione per risultati accurati. L'agarosio non è un buon mezzo per confrontare frammenti che differiscono di una singola base.
Sono diventati lo strumento principale per il genotipaggio. Permettono di determinare rapidamente ed economicamente frammenti che differiscono di una singola base azotata. Come per l'elettroforesi su agarosio, i frammenti DNA vengono prima amplificati con PCR. Tuttavia, un primer è marcato con colorante fluorescente che colora il frammento. I campioni sono separati per dimensione migrando in un polimero gelatinoso sotto corrente elettrica. Frammenti più piccoli migrano più velocemente. Mentre migrano verso la fine del polimero, una telecamera digitale registra il colore e invia i dati a un computer per l'analisi. Le apparecchiature di sequenziamento automatico sono usate in identificazione forense e test di paternità.
Gli strumenti di sequenziamento next-gen sono emersi rapidamente dal 2006. Questa tecnologia combina amplificazione PCR e sequenziamento per determinare milioni di basi simultaneamente. Il processo inizia con PCR; tuttavia, primer diversi sono legati a perle mescolate in un'unica reazione, permettendo l'amplificazione di migliaia di regioni contemporaneamente.
I sequenziatori next-gen separano poi i frammenti per dimensione e permettono l'analisi di una moltitudine di regioni genomiche. Svantaggio come strumento di genotipaggio quando interessa confrontare una singola regione. Vantaggio: il genoma isolato da una singola cellula fornisce materiale sufficiente per amplificazione PCR. Confrontare i genotipi di cellule normali e anomale isolate dallo stesso individuo aiuta a identificare cellule cancerose e potenziali trattamenti.
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