Colture tissutali: Tecniche, applicazioni e tipi cellulari
Cos'è la coltura tissutale
La coltura tissutale è la propagazione di cellule in un mezzo di crescita liquido in laboratorio per vari scopi scientifici. Ad esempio, le colture tissutali sono usate nella diagnosi di malattie genetiche, come mezzo per coltivare patogeni intracellulari come batteri o virus, o nelle indagini sulle cellule stesse.
Cellule per colture tissutali
- Alcune cellule aderiscono al fondo delle piastre di Petri o rimangono sospese nel liquido.
- Le cellule possono essere di origine vegetale o animale.
- Le cellule usate possono essere primarie (prelevate direttamente da un organismo) o di una linea cellulare mantenuta in coltura.
- Le linee cellulari sono spesso cellule tumorali, fattore da considerare nella pianificazione e interpretazione degli esperimenti.
Maneggiare le cellule con delicatezza
Le cellule aderenze vengono rimosse dalla piastra per il passaggio tramite raschiatura o con una proteasi, generalmente tripsina ed EDTA.
- La raschiatura uccide molte cellule e va usata solo per preparare lisati cellulari (preparazioni liquide del contenuto cellulare per analisi) o quando tripsina/EDTA devono essere assolutamente evitate.
- La tripsinizzazione rimuove non solo le proteine che ancorano le cellule alla piastra, ma la maggior parte delle proteine di membrana. Le cellule si arrotondano e impiegano tempo, solitamente una notte, per riattaccarsi.
- Aggiungere una quantità minima di tripsina (circa 1 mL per fiasca da 25 cm²), agitare per 5 secondi o meno per coprire il monolayer, poi rimuovere la tripsina in eccesso riduce l'esposizione. Lasciare le cellule a riposo nell'incubatore durante la tripsinizzazione.
- Dopo il distacco, aggiungere terreno con siero e aspirare delicatamente il lisato su e giù nella pipetta. Lasciare un po' di terreno nella piastra mentre si pipetta per rompere gli agglomerati e ottenere una sospensione uniforme.
- Non aspirare bolle nella pipetta. Non mescolare vigorosamente né vorticare la sospensione cellulare: le cellule sono molto fragili in questo stato arrotondato.
Inattivazione termica del siero: sì o no?
Quando le tecniche di coltura cellulare erano agli inizi, il siero fetale bovino (FBS) conteneva proteine del complemento, proteine del sistema immunitario che lisano le cellule. L'inattivazione termica dell'FBS a 56°C per 30 minuti rende inattive le proteine del complemento. Il preriscaldamento dell'FBS a 37°C è sufficiente a inattivarle.
In passato, l'inattivazione termica uccideva anche micoplasmi e altri contaminanti. All'epoca, la sterilizzazione per filtrazione usava filtri da 0,45 µm. Oggi si filtra l'FBS e i terreni attraverso filtri da 0,1 µm o anche 0,04 µm: nessun micoplasma passa.
Resta la domanda se inattivare termicamente o meno.
- L'inattivazione termica degrada tutti i componenti dell'FBS (vitamine, aminoacidi, fattori di crescita), potenzialmente sotto la soglia per alcune linee cellulari esigenti.
- Se si lavora con una linea cellulare a crescita lenta o esigente, considerare la sola sterilizzazione per filtrazione dell'FBS: potrebbe aumentare la robustezza delle cellule.