Elettroforesi su Gel: Principi, Applicazioni e Tecniche

L'elettroforesi su gel è un metodo per separare, identificare e caratterizzare miscele di proteine o acidi nucleici. Campioni denaturati migrano sotto campo elettrico in un gel sottile e umido, tipicamente di poliacrilammide o agarosio. I campioni separati sono colorati per diventare visibili. Usata in ricerca su proteine/acidi nucleici e in ospedali per identificare proteine insolite o pattern DNA per diagnosticare malattie, difetti genetici e relazioni genetiche.

Preparazione del Campione

Aggiungendo un detergente come dodecilsolfato di sodio (SDS) a proteine o acidi nucleici, il detergente si associa e svolge (denatura) proteine e acidi nucleici. La denaturazione delle proteine facilita la determinazione del peso molecolare in elettroforesi. Quantità tipica: 100-500 ng per banda per proteine, 5-100 ng per banda per acidi nucleici, volume totale 25-40 µL.

Gel

Il gel, di poliacrilammide o agarosio, può essere preparato o acquistato. Simile a gelatina: per lo più acqua, ma abbastanza solido da maneggiare. Contiene tampone per controllare pH. Molto sottile (1-2 mm) e rettangolare. Un lato ha un «pettine» con denti mancanti: gli spazi sono i pozzetti (wells).

Caricamento del Campione

Si pone il gel in camera con tampone; proteine denaturate aggiunte ai pozzetti. Campioni di peso molecolare noto vanno nei pozzetti esterni. Gel con diverse concentrazioni di poliacrilammide: bassa forza (4%) per alte masse molecolari, alta (12%) per basse masse. Gel a gradiente varia la forza e separa ampia gamma di proteine con qualche perdita di risoluzione.

Elettromigrazione

Applicando alta tensione, le proteine denaturate migrano verso il fondo del pozzetto. Maggiore il peso, minore la velocità. Spegnendo la corrente, la migrazione si arresta. Si estrae il gel e si agita in colorante. Coloranti organici (blu Coomassie) o metallici per proteine; fluorescenti (bromuro di etidio) per acidi nucleici.

Analisi dei Risultati

Rimosso il colorante in eccesso, le miscele si separano in bande a scala. La posizione delle bande confrontata con la distanza degli standard determina il peso molecolare del campione in ogni banda. Il gel può essere disidratato con alcol ed essiccato per conservazione. L'intensità del colore della banda misura la concentrazione della proteina.

Sviluppo del Protocollo

Protocolli standard esistono per proteine note. Per campioni sconosciuti, forza del gel, tipo/pH tampone, tensione, tempo corsa, colorante vanno ottimizzati per miglior separazione e segnale.

Protocolli

(Sezione vuota nell'originale)