Come misurare NADH

NAD e NADH sono entrambi i nucleotidi piridinici coinvolti nel metabolismo. NADH e NAD sono co-enzimi trovano nei mitocondri, le centrali energetiche della cellula. Sia NAD e NADH sono coinvolti in reazioni cellulari come la respirazione e la fotosintesi dove si generano energia e idrogeno. NAD e NADH combustibile reazioni biochimiche che richiedono un certo numero di enzimi per produrre ATP, la fonte principale di energia nelle cellule. Cose che ti serviranno
cellule o tessuti in fase di studio
NADH assay kit
PBS
ghiaccio secco
Riscaldamento blocco
96 pozzetti
Centrifuga
Etichettato tubi
Piastra lettore
Vortex
concentrazione nota di NADH
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Assay
1

Lavare le cellule o tessuti in fase di studio con fosfato freddo soluzione salina tamponata, PBS. Estrarre cellule o rompere il tessuto in tampone di estrazione collocando la miscela in ghiaccio secco per 20 minuti e poi a temperatura ambiente per 10 minuti. Ripetere.
2

vortex per 10 secondi. Gira in una centrifuga per 5 minuti a pellet di cellule o frammenti di tessuto. Rimuovere il surnatante, la fase liquida, e mettere il liquido in una provetta pulita.
3

Filtrare il surnatante attraverso un filtro speciale per rimuovere gli enzimi che si ripartizione NADH.
4

Rimuovere 200 micro litri, posto in una provetta pulita e calore a 60 gradi Celsius in un blocco di riscaldamento per 30 minuti per denaturare NAD. Raffreddare e centrifugare e rimuovere fase liquida. Trasferire 50 microlitri in una piastra a 96 pozzetti; ogni campione deve essere in due o tre esemplari. Per determinare totale NAD, NADt, non fa caldo.
5

Preparare e aggiungere mix in bicicletta per la piastra a 96 pozzetti. Mescolare ed incubare per 5 minuti. Aggiungere 10 microlitri di sviluppatore e lasciare incubare a temperatura ambiente per un massimo di 4 ore. Aggiungere soluzione bloccante. Leggi il cambiamento di colore su un lettore di piastre o fluorimetro a seconda del kit.
Curva standard e calcolo
6

Preparare una curva standard prendendo una concentrazione nota di NADH e diluizione in tampone di estrazione. Diluire in diverse concentrazioni, assicurando il volume finale rimane la stessa di campioni di prova. Piastra sulla stessa piastra a 96 pozzetti come campioni di prova. Leggere la densità ottica.
7

Disegna grafico curva standard con concentrazione sull'asse X e la densità ottica sull'asse Y. Prendete una media di ciascun campione e leggere la concentrazione dal grafico della curva standard.
8

Calcolare il rapporto NAD /NADH sottraendo totale NAD, NADt, dal NADH e quindi dividendo per NADH.