Come usare i livelli di GSH nel rilevare ROS

Glutatione, o GSH, è un tripeptide non essenziale a base di cisteina, glutammato e glicina. Esso è un potente antiossidante che protegge le cellule e gli organi del corpo dagli effetti nocivi delle ROS, o specie reattive dell'ossigeno, che sono formati da ossigeno molecolare come risultato di vari processi metabolici del corpo. Gli antiossidanti, come il glutatione, neutralizzare il ROS e impedire loro di interagire con e danneggiare il DNA e le proteine ​​nelle cellule. Il rapporto tra ossidato e ridotto sotto forma di GSH nel vostro corpo è indicativo del ROS-stress ossidativo nel corpo. Cose che ti serviranno
Siringa
farfalla ago
Centrifuga
sodio eparina
Freezer
Sulfosalicylic acido
GSH Reazione Agente
micropiastre
Sorgente
GSH soluzione standard
Mostra più istruzioni
1

consumare circa 2 ml di sangue venoso alla vena anticubetal con un ago a farfalla 23-gauge attaccato ad una siringa da 5 ml. Aggiungere il campione per testare provette contenenti eparina sodica e capovolgere delicatamente il tubo per la miscelazione.
2

Raccogliere i globuli rossi centrifugando il campione a 2500 giri al minuto per cinque minuti. Congelare e scongelare il campione tre volte per rompere le cellule. Centrifugare la soluzione lisato cellulare per 10 minuti a 12.000 rpm e 4 gradi, e raccogliere il surnatante.
3

Rimuovere la proteina dal campione con l'aggiunta di 5 per cento di acido solfosalicilico e centrifugando il campione a 12.000 rpm per cinque minuti a 4 gradi. Conservare il surnatante deproteinati a -112 gradi.
4

Mescolare un agente di rilevamento tiolo, GSH reduttasi, nicotinamide adenina dinucleotide fosfato e tampone in proporzioni indicate dal produttore del kit per rendere la miscela di reazione GSH. L'importo di ciascuna sostanza chimica dipende dal numero di prove che si intende eseguire. Diluire la miscela di reazione GSH nel 5 per cento di acido solfosalicilico per ottenere concentrazioni di 16, 32, 63, 125, 250 e 500 microlitri.
5

Aggiungi 1 a 10 microlitri del campione di sangue deproteinati nei pozzetti di una micropiastra. Aggiungere diluiti serialmente soluzione standard GSH, disponibile nel kit di test, ad ogni pozzetto per portare il volume totale di ciascun pozzetto a 10 microlitri.
6

Aggiungere 90 microlitri di miscela di reazione GSH apportate al punto 4 per ciascun bene in micropiastra. Mescolare il reagente agitando la piastra per 30 secondi.
7

l'estinzione immediatamente posizionando la lastra sotto luce con lunghezze d'onda di 405 e 415 nanometri. Incubare la piastra per 30 minuti. Le letture di assorbanza dopo ogni cinque minuti durante l'incubazione.
8

Diluire 6 millimolare del campione processato con il 5 per cento di acido solfosalicilico e soluzione sulfonato trifluromethane. Questo eliminerà tutti i GSH ridotto dalla soluzione. Aggiungere 1-10 micoliters di questa soluzione ai pozzetti di micropiastre e ripetere i punti 5, 6 e 7. Questo aiuterà a stimare la quantità di GSH ossidato nel campione.
9

Plot l'assorbanza e la concentrazione del campione su un grafico per ottenere la curva di GSH sia ridotto e glutatione ossidato. Calcolare il rapporto tra le due forme di GSH. Livelli elevati livelli di GSH ossidativi indicano lo stress ossidativo e ROS.