Rilevamento NADH: metodi e analisi scientifica

Materiale necessario

• Ghiaccio secco
• Microcentrifuga
• Provette Eppendorf

Protocollo

Ricostituzione reagenti

1. Portare cycling buffer a temperatura ambiente (ideale 22 °C).
2. Ricostituire NAD cycling enzyme mix con 220 µL cycling buffer. Congelare a < -70 °C.
3. Ricostituire NADH developer con 1,2 mL ddH2O. Mescolare delicatamente, non vortex.
4. Ricostituire NADH standard con 200 µL DMSO puro.

Preparazione campioni

5. Lavare cellule con tampone fosfato salino (PBS).
6. Pellet 2×10⁵ cellule per assay in provetta microcentrifuga, 2.000 RPM × 5 min.
7. Estrarre con 400 µL NAD/NADH extraction buffer: 2 cicli freeze-thaw (20 min ghiaccio secco, 10 min RT). Vortex 10 sec esatti.
8. Centrifugare campioni 14.000 RPM × 5 min.
9. Trasferire supernatante NAD/NADH in provetta pulita.

Protocollo assay

10. Diluire 10 µL NADH standard in 990 µL extraction buffer. Aggiungere 0,2,4,6,8,10 µL in duplicato in piastra 96 pozzetti per standard 0,20,40,60,80,100. Ultimo pozzetto: 50 µL buffer.
11. Trasferire 50 µL campioni estratti in duplicato.
12. Decomporre NAD: 200 µL campione in Eppendorf, 60 °C × 30 min in bagno termostatato. Raffreddare su ghiaccio. Centrifugare per precipitati. Trasferire 50 µL in duplicato.
13. Miscelare: 100 µL NAD cycling buffer mix + 2 µL NAD cycling enzyme. Aggiungere 100 µL a ogni pozzetto standard/campioni.
14. Incubare RT × 5 min (conversione NAD→NADH).
15. Aggiungere 10 µL NADH developer per pozzetto. Attendere RT 1-4 ore.
16. Leggere piastra e calcolare NADH.