Sequenziazione N-terminale: metodi e importanza nell'analisi proteica

La degradazione di Edman — un processo ben noto per identificare l'amminoacido N-terminale di una proteina — richiede la scissione dell'amminoacido, seguita da identificazione usando cromatografia o elettroforesi. I processi automatizzati accelerano la sequenziazione N-terminale.

I Fatti

• Le proteine prodotte all'interno di singole cellule agiscono come ormoni, enzimi e altri importanti regolatori. Una mutazione genetica che risulta in una proteina anomala potrebbe avere gravi conseguenze per la salute.

Processo

• L'amminoacido N-terminale viene scisso per trattamento con uno di diversi reagenti, poi idrolizzato per formare un amminoacido separato. Cromatografia a strato sottile, HPLC o elettroforesi determinano la dimensione dell'amminoacido, e la confrontano con uno standard di dimensione nota. Il nuovo estremo N-terminale della proteina rimanente può essere similmente scisso per identificazione.

Automazione

• Applied Biosystems ha guidato lo sviluppo dell'automazione della degradazione di Edman, che lega una proteina purificata a una membrana e la tratta con fenilisotiocianato. L'amminoacido libero viene automaticamente iniettato in un sistema HPLC per identificazione.

Complicazioni

• Le proteine devono rimanere relativamente pure e libere da contaminanti per determinare accuratamente l'amminoacido N-terminale. I limiti della degradazione di Edman richiedono grandi molecole proteiche frammentate in catene peptidiche non più lunghe di 50 amminoacidi.