Salute e malattia
L'elettroforesi su gel di poliacrilammide, o PAGE, è una tecnica comunemente usata per la separazione di molecole organiche in un campione biologico. Molecole con dimensioni e peso inferiori migrano più velocemente su un gel di poliacrilammide quando viene applicata una corrente elettrica. Bande chiare e distinte sono generalmente osservate dopo che il gel completato è incubato in una particolare colorazione. È un metodo relativamente semplice. Tuttavia, l'assenza di bande o bande che sbavano o non sono pulite potrebbero indicare un problema in uno o più passaggi del metodo. Dovresti seguire linee guida base per risolvere i problemi di un metodo di elettroforesi su gel quando i risultati non sono come attesi.
Inizia dall'ultimo passaggio dell'elettroforesi su gel e lavora all'indietro. Per l'elettroforesi su gel, l'ultimo passaggio è la procedura di colorazione usata per osservare le bande del campione. Pochi problemi dovrebbero verificarsi durante la colorazione. Tuttavia, le colorazioni in polvere dovrebbero essere ben disciolte nel buffer appropriato prima di essere usate per colorare un gel. Accertati che sia stata usata la corretta concentrazione di colorante.
Controlla l'alimentatore. L'assenza di bande potrebbe indicare che l'impostazione di corrente o tensione era troppo alta e i campioni di test sono migrati fuori dal gel. Impostazioni alte possono anche causare la migrazione dei componenti del campione attraverso il gel troppo velocemente, causando scarsa risoluzione e bande che appaiono non pulite. I campioni potrebbero non migrare attraverso il gel se l'impostazione dell'alimentatore è bassa. I campioni possono anche derivare dal pozzetto dove sono stati caricati e non migrare attraverso il gel.
Controlla l'acrilammide liquida usata per colare il gel di poliacrilammide. Tipicamente, la percentuale di acrilammide usata per colare un gel di poliacrilammide varia dal 5 al 15%. Campioni composti da molecole più grandi sono caricati su un gel al 5% perché i frammenti grandi si muovono più lentamente su gel con percentuale di acrilammide più alta. Molecole piccole sono caricate su un gel a percentuale più alta perché una bassa concentrazione di gel non sarebbe capace di risolvere campioni più piccoli.
Controlla i reagenti usati per polimerizzare l'acrilammide. Un gel di poliacrilammide si forma per polimerizzazione di una miscela liquida costituita da bisacrilammide e acrilammide. Persolfato d'ammonio e TEMED vengono aggiunti all'acrilammide per catalizzare la formazione del gel. Tipicamente, l'acrilammide dovrebbe mostrare segni di polimerizzazione (formazione del gel) 15 minuti dopo che persolfato d'ammonio e TEMED sono stati aggiunti. Polimerizzazione che avviene troppo velocemente è il risultato di alte quantità di persolfato d'ammonio. Troppo poco persolfato d'ammonio può causare polimerizzazione incompleta o irregolare.
Conferma la quantità dei campioni caricati. Alte concentrazioni di campioni possono muoversi lentamente attraverso il gel e ridurre la risoluzione delle bande. Una concentrazione di campione bassa potrebbe non essere osservata dopo che il gel è stato colorato. Queste colorazioni hanno limitazioni sulla quantità minima di campione che può essere immaginata come risultato della sensibilità della colorazione.
Conferma la qualità dei campioni caricati. Sali e altri contaminanti presenti in un campione possono influenzare il movimento del campione lungo il gel. L'elettroforesi è il risultato di corrente elettrica che attraversa un gel che contiene un buffer conduttore; alte concentrazioni di sale nel campione possono influenzare il movimento di questa corrente attraverso il gel. L'isolamento del campione dovrebbe incorporare un kit di purificazione che produca un campione relativamente puro.
Rivedi la letteratura o il protocollo scritto per determinare se il PAGE appropriato è stato usato per condurre l'esperimento. La percentuale di acrilammide in PAGE è specifica per la dimensione del campione da testare. La letteratura potrebbe anche fornire informazioni specifiche rispetto all'impostazione dell'alimentatore e alla velocità di migrazione del campione.
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