Crioconservazione procedure

procedure di crioconservazione sono quelle che permettono alle cellule di essere conservate a tempo indeterminato, utilizzando temperature molto fredde, di sospendere le attività metaboliche. Ci sono due tipi principali di procedure di crioconservazione: equilibrio (convenzionale congelamento lento) e di non equilibrio o ultra-rapido congelamento (vetrificazione). Il termine vetrificazione deriva dal latino "vitreo" o vetroso. Entrambe le procedure utilizzano crioprotettori con proprietà antigelo di tipo per prevenire danni cellulari durante il processo di congelamento. Una volta che le cellule vengono congelate o vetrificate, possono essere conservati indefinitamente immergendoli in azoto liquido, un fluido estremamente fredda con una temperatura di -196 C (-321 F). Per ripristinare l'attività metabolica nella cellula dopo lo scongelamento, crioprotettori tossici devono essere rimossi dalla cella e il normale equilibrio acqua gradualmente ripristinato come la cella viene riportato ad una temperatura normale funzionamento. Panoramica | Photos.com Panoramica
procedure di crioconservazione

sono quelle che permettono alle cellule di essere conservate a tempo indeterminato, utilizzando temperature molto fredde, di sospendere le attività metaboliche. Ci sono due tipi principali di procedure di crioconservazione: equilibrio (convenzionale congelamento lento) e di non equilibrio o ultra-rapido congelamento (vetrificazione). Il termine vetrificazione deriva dal latino "vitreo" o vetroso. Entrambe le procedure utilizzano crioprotettori con proprietà antigelo di tipo per prevenire danni cellulari durante il processo di congelamento. Una volta che le cellule vengono congelate o vetrificate, possono essere conservati indefinitamente immergendoli in azoto liquido, un fluido estremamente fredda con una temperatura di -196 C (-321 F). Per ripristinare l'attività metabolica in cella dopo lo scongelamento, crioprotettivi tossici devono essere rimossi dalla cella e il normale equilibrio acqua gradualmente ripristinato come la cella è tornato a una temperatura normale funzionamento.
Cell- Fattori specifici

La procedura utilizzata per crioconservare cellule o tessuto dipende da diversi fattori tra cui la dimensione della cella, la quantità di fluido cellulare (citoplasma) e la complessità della cellula (singola cella o tessuto). Cellule con una grande quantità di citoplasma quali uova sono più difficili da crioconservare di cellule con citoplasma solo residuo, come le cellule spermatiche. Crioconservazione di tessuto ovarico è più impegnativa perché almeno tre differenti tipi cellulari di varie dimensioni sono presenti nel tessuto ovarico, ciascuno con diverse esigenze congelamento ottimali. Protocolli di congelamento lento sono stati usati con successo con vari tipi di cellule. Vetrificazione attualmente è più efficace con il congelamento cella singola e meno efficace con i tessuti, ma la ricerca è ancora in corso per ottimizzare la vetrificazione dei tessuti.
Ruolo di crioprotettori

Il citoplasma di una cella contiene acqua, che si trasforma in cristalli di ghiaccio a temperatura di congelamento. Quando il ghiaccio si forma all'interno di una cella, la cella è triturato e muore. Pertanto, il fluido nella cella deve essere rimosso prima di raggiungere temperature di congelamento per evitare danno cellulare. Vari tipi di antigelo (crioprotettore) fluidi possono essere utilizzati per disidratare la cella prima del congelamento, compresi glicerolo, propandiolo, dimetil sulfoxde (DMSO), etanolo e zuccheri come saccarosio e trealosio. Il tasso ottimale di raffreddamento (e scongelamento) dipende dal tipo di crioprotettore utilizzato e dalla caratteristica della cellula o tessuto per essere (o che era) congelati. Cryoprotectants sono tossici per le cellule di metabolizzare in modo esposizioni cellulari a crioprotettivi a temperature più calde metaboliche devono essere ridotti al minimo o evitate. Dopo lo scongelamento o riscaldamento delle celle, cryoprotectants devono essere completamente rimossi dalla cella prima attività metabolica viene ripristinato.
Equilibrium Versus non equilibrio Crioconservazione Procedura

Il tasso di congelamento dipende dal fatto che il protocollo di congelamento è di equilibrio-o non-equilbrio-based. Per le procedure di tipo di equilibrio, la velocità di congelamento ottimale si ottiene quando c'è un equilibrio tra il tasso a cui la cella è essere disidratato di acqua e il tasso al quale l'acqua all'esterno della cellula viene trasformato alla fase ghiaccio. Questi protocolli di equilibrio o slow-freeze di solito prendono ore per completare e un computer utilizzato per eseguire un tasso congelatore programmabile per garantire che le tariffe di congelamento sono esattamente come richiesto. Vi è tipicamente un passo "hold" nel protocollo vicino all'inizio per consentire la creazione manuale di cristalli di ghiaccio avviamento o "semina" nel liquido all'esterno delle cellule.

Vetrificazione, un approccio completamente diverso congelamento che non si basa su rampe e raggiungere un equilibrio tra la disidratazione e la formazione di cristalli di ghiaccio è utilizzato. Vetrificazione è così ultra rapida che non c'è abbastanza tempo per la formazione di ghiaccio e il fluido cellulare viene convertito direttamente in una fase vetrosa o vetro, senza danneggiare la cella. Congelatori rate programmabili non sono necessari perché la cellula è direttamente immerso in azoto liquido estremamente freddo, raggiungendo uno stato vetroso istantaneo.
Lento-Freeze Procedura

Il primo passo di la procedura di congelamento è lento per esporre la cellula a crioprotettore in modo graduale graduale per consentire lentamente equilibramento della cella con il crioprotettore mentre rilasciando acqua. Una volta che le cellule sono state cancellate della maggioranza acqua cellulare, le cellule nel fluido crioprotettore sono posti in un contenitore di qualche tipo, come ad esempio una cannuccia, una fiala di vetro o di un volume vial.The plastica di liquido che circonda le cellule per congelamento lento è in genere meno di un cucchiaino e può essere solo poche gocce. Il contenitore pre-etichettato è riempito, sigillato e messo in un congelatore programmabile, che diminuisce lentamente la temperatura del contenitore lungo un periodo di minuti o ore a temperature molto basse. Dopo pochi minuti di raffreddamento, cristalli di ghiaccio avviamento devono essere formati all'interno del contenitore da "seminando" il contenitore. Semina viene eseguita utilizzando un utensile (ad esempio, pinze) che sono state pre-raffreddato in azoto liquido a toccare il contenitore e causare la formazione di cristalli di ghiaccio. Questo cristallo antipasto avvierà la formazione di cristalli di ghiaccio controllata in un punto, a distanza di sicurezza dalle cellule. Una volta che la semina è completa, il resto delle rampe di raffreddamento in grado di procedere. Quando il contenitore raggiunge temperature tra -30 e -85 C, contenitore che contiene le celle può essere immerso direttamente in azoto liquido per completare il raffreddamento a -196 C.
Vitrificazione

ultra-rapida non equilibrio procedure come la vitrificazione agghiacciante utilizzare concentrazioni più elevate di crioprotettivi accoppiato con un tasso di congelamento quasi istantaneo ottenuto immergendo le cellule direttamente in azoto liquido. Vetrificazione bypassa la fase di formazione di cristalli di ghiaccio e muove l'acqua direttamente in una fase simile al vetro. Vetrificazione raggiunge lo stesso endpoint come congelamento lento, ma ad un tasso di -3000C/min, rispetto a 10C/min o più. Per vetrificazione, le cellule sono in genere collocati sulla punta di una cannuccia e crioprotettore eccesso viene rimosso, lasciando appena sufficiente in modo che la cellula si aggrappa al contenitore dalla tensione superficiale, prima di immergersi in azoto liquido. Perchè è così rapido congelamento, la durata dell'esposizione al crioprotettori è molto meno, e concentrazioni molto più elevate di crioprotettori può essere tollerato dalla cellula. Il riscaldamento della cella per riportarlo alla normale funzionamento metabolico deve essere anche incredibilmente rapida. La manipolazione dei campioni vetrificati è molto più esigenti di campioni lento congelati perché anche una breve esposizione ad una temperatura superiore a quella dell'azoto liquido può avviare un processo di riscaldamento non pianificati e rigelo, che è dannoso per la cellula.