Come prova di acidi nucleici

Test per acidi nucleici viene effettuata in diagnostica medica, al fine di individuare gli agenti patogeni, come virus o batteri. Questi test sono molto più rapidi e, quindi, consentono a un medico per iniziare un trattamento per un paziente che normalmente avrebbe dovuto attendere la conferma di infezione usando più lungo e noioso saggi a base di anticorpi. Il processo è noto anche come test di amplificazione dell'acido nucleico, ed include un metodo noto come "amplificazione transcriptasi inversa" mediante reazione a catena della polimerasi. Dal momento che questa è una procedura scientifica altamente specializzata, conoscenze avanzate e le competenze in tecniche di biologia molecolare e la teoria è necessaria. Cose che ti serviranno
provette PCR
PCR cycler
Pipette e filtro e consigli Guanti
Cellule
Trizol o altra estrazione di RNA reagente
PCR buffer di Taq polimerasi

RT-PCR primer a 1 mg /ml di concentrazione
RNase-Free Water
dNTP
MgCl2
primer random a 1,8 mg /ml di concentrazione
SuperScript II trascrittasi inversa

Mostra Altre istruzioni
trasformazione e preparazione di RNA
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Celle di raccolta con un reagente di estrazione di RNA, come Trizol. 1 ml, è sufficiente per raccogliere le cellule da un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti. Le cellule vengono accuratamente pipettati su e giù per omogeneizzare e poi effettuare la procedura di estrazione, come descritto nella scheda tecnica Trizol. Brevemente, estratto con cloroformio, quindi si centrifuga per separare le fasi di DNA, RNA e proteine. Recuperare solo la fase di RNA incolore e precipitato con isopropanolo. Dopo l'incubazione, centrifughe che e ripulire il conseguente pellet con diversi lavaggi con etanolo. Poi risospendere il pellet in acqua RNase-free.
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Per la trascrizione inversa, denaturare esattamente 5 microgrammi di RNA a 65 gradi Celsius in un microlitro (ul) volume di acqua RNase-free 10, poi rapidamente posto sul ghiaccio. Per ogni reazione, unire 10 ul di RNA, 3 pl di tampone di reazione PCR 10X, 2,5 ul di 10 millimolare dNTP, 6 l di cloruro di magnesio 25 millimolare, 1 ul di primer casuali di 1,8 milligrammi per millilitro concentrazione, e 0,5 ul di SuperScript II enzima trascrittasi inversa. Rabboccare ogni reazione con 17 ul di acqua RNase-free. Incubare le provette a temperatura ambiente per dieci minuti e poi a 42 gradi Celsius per un'ora per produrre il cDNA, poi denaturare a 95 gradi Celsius e rapidamente ghiaccio per fermare la reazione.
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per una reazione a catena della polimerasi, di nuovo impostare una miscela di reazione in provette da 0,5 ml, combinando 6 ul di cDNA fatta nella reazione di trascrizione inversa, 1,5 ul di tampone di reazione PCR 10X, 0,2 microlitri di Taq polimerasi, 0,5 microlitri di primer reverse e anche di primer forward, quindi rabboccare ogni tubo con 10,3 ul di acqua RNase-free. Per eseguire le reazioni, impostare un termociclatore (cioè una macchina che esegue la reazione a catena della polimerasi) per 30 cicli, come segue: 95 gradi Celsius per 0,5 minuti per denaturare, seguito da 60 gradi Celsius per 45 secondi per temprare, e infine 72 gradi Celsius per 1 minuti per estendere la trascrizione sintetizzato.