Intracellulare Protocollo di colorazione per Citometria a Flusso

La citometria a flusso è uno strumento che è utile nello studio delle proteine ​​cellulari . Esso utilizza l'emissione di luce o fluorescenza dalle proteine ​​all'interno della cellula . Anticorpi o sonde taggati con fluorescenza sono utilizzati per studiare le proteine ​​specifiche . Citometria a flusso è usata per diagnosticare una serie di malattie , compreso il cancro , ma è anche utile nella ricerca medica . Celle di fissaggio

Le cellule devono essere fissati per mantenere la stabilità delle proteine ​​intracellulari . Un certo numero di fissativi può essere usata come la formaldeide o acetone ghiacciato . Seguendo fissazione, la membrana cellulare deve essere permealized per consentire l'anticorpo di entrare nella cellula . Detersivi come Triton o NP -40 , o metanolo ghiacciata può essere usato per fare i fori nella membrana cellulare .
Colorazione

Lavare le cellule in tampone di bloccaggio 0,5 per cento di BSA diluito in tampone fosfato , BSA /PBS . Le cellule sono incubate in tampone bloccante per ridurre il legame non specifico. Aggiungere anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio e lasciate ad incubare a temperatura ambiente , per lunghezza ottimizzata di tempo . Lavare con tampone di bloccaggio .
Analisi

Incubare l'anticorpo secondario , che viene etichettato con un tag fluorescente , a temperatura ambiente per 30 minuti . Per rimuovere le cellule non legate lavaggio dell'anticorpo nel tampone di bloccaggio . Spin le cellule in una pallina e poi risospendere in PBS e analizzare il citofluorimetro .