Cell- Based protocollo ELISA

ELISA , o enzyme-linked test immunoenzimatico , è usato come strumento diagnostico in medicina e nella ricerca biologica per quantificare la quantità di una proteina specifica . ELISA utilizza anticorpi per rilevare la proteina di interesse e di un reagente che produce un colore . La quantità di colore riferisce alla quantità di proteina . Cultura

Cells cellulari devono essere posti nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di terreni di crescita e le cellule lasciate riposare una notte . Se stai studiando la reazione delle cellule di un fattore, le cellule dovrebbero essere siero -fame per 24 ore e poi stimolate con il fattore in fase di studio .
Fissazione e anticorpo primario

Dopo la rimozione dei mezzi di comunicazione , le cellule vengono trattate con un fissativo , come il 3 per cento di formaldeide , o metanolo . La membrana cellulare deve essere permeabilizzate per consentire l'anticorpo di penetrare nella cellula. Permeabilizzazione può essere ottenuto mediante l' impiego di 0,1 per cento Triton , se non è stata precedentemente utilizzata metanolo . Legame non specifico può essere prevenuta con l'uso di siero di vitello fetale cento 10 diluito in PBS . Dopo la rimozione del blocco , l'anticorpo primario può essere applicata ed incubata per un'ora .
Anticorpo secondario e Stain

Rimuovere l'anticorpo primario , e lavare tre volte. Aggiungere un anticorpo secondario legato ad un agente di rilevamento , ad esempio perossidasi di rafano . Incubare per un'ora . Washington Aggiungi soluzione di substrato chemiluminescente . Sviluppare ed eseguire la scansione della piastra per l'intensità del colore .