Elettroforesi su gel di agarosio: guida all'analisi frammenti DNA

Principio dell'elettroforesi su gel di agarosio

Metodo più comune per analisi visiva frammenti DNA, permette di discernere frammenti per dimensione. Il gel di agarosio sostiene un campo elettrico (non magnetico) e, poiché il DNA ha carica negativa, migra verso il polo positivo. Frammenti piccoli migrano più velocemente, grandi più lentamente. Frammenti colorati fluorescentemente con agente intercalante (bromuro di etidio) per confronto campioni multipli.

Materiale necessario

• Gel agarosio 0,7%-2%
• Buffer: Tris-borato-EDTA (TBE), tris-acetato-EDTA (TAE), sodio litio acetato (LA), acido borico (SB)
• Bromuro di etidio
• Colorante caricamento gel
• Vaschetta gel
• Camera elettroforesi
• Guanti
• Occhiali protettivi
• Pipetta
• Pettine elettroforesi

Procedura completa

Preparazione gel agarosio 0,7%

1. Pesare 0,7 g polvere agarosio in beuta conica 250 ml.
2. Aggiungere 100 ml buffer 1X (TAE, TBE, SB o LB) nella beuta.
3. Scaldare microonde o Bunsen ~1 min finché soluzione limpida e agarosio disciolto.
4. Raffreddare a 55-60°C.
5. Aggiungere 1 µL bromuro di etidio con pipetta adeguata (solitamente 1 ml). Mescolare.
6. Versare gel lentamente in vaschetta, evitare bolle. Se mancano dighe pozzi, usare nastro adesivo.
7. Inserire pettine elettroforesi con posizione/orientamento corretti. Lasciare solidificare ~25 min.
8. Immergere gel nello stesso buffer usato (1X), fino a 5 ml buffer corsa.

Preparazione e caricamento DNA

9. Trasferire 5-10 µL campione(i) da tubi reazione a tubi freschi (non necessario se si usa tutto il mix).
10. Aggiungere buffer caricamento 0,2X a ogni tubo campione.
11. Rimuovere pettine lentamente, senza rompere gel o creare spazi.
12. Aggiungere 5-12 µL marcatore DNA appropriato al primo pozzo (scelta dipende da dimensione frammenti attesi).
13. Caricare 5-10 µL campioni nei pozzi rimanenti, uguale quantità marcatore in ultimo pozzo.
14. Inserire elettrodi in camera collegando cavi alle prese corrette. Impostare 50-150 V.
15. Far correre gel 1-4 ore.

Analisi risultati

16. Rimuovere gel da camera: stanza UV per identificazione visiva, o macchina per fotografare.
17. Misurare distanza migrazione bande marcatore.
18. Tracciare distanze vs dimensioni bande su carta semilog, tracciare linea best-fit.
19. Calcolare distanze bande sconosciute.
20. Stimare dimensioni bande sconosciute: tracciare linea verticale da distanza banda sconosciuta a linea best-fit.
21. Da punto incontro, tracciare linea orizzontale ad asse dimensioni.