Come rilevare NADH

nicotinamide adenina dinuceltoide ( NADH ) , abbreviato " NAD " , è un coenzima presente nelle cellule viventi che produce reazioni chimiche nelle proteine ​​. Le aziende farmaceutiche studiano NADH a causa del suo processo di metabolismo , e sinteticamente creare per una serie di scopi . Poiché NADH è microscopica , l'occhio nudo non può individuare esso . Avete bisogno di test scientifici e di un kit di analisi per rilevare la sua presenza . Cose che ti serviranno ghiaccio
secco
Micro - centrifuga
Eppendorf tubi

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Ricostituzione dei reagenti
1

Impostare il buffer di ciclismo su un contatore e consentire il buffer raggiunga la temperatura ambiente . La temperatura ideale per il buffer è di 22 gradi centigradi.
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Ricostituire il NAD ciclismo mix enzima con esattamente 220 ​​microlitri di buffer di ciclismo . Congelare la soluzione a temperature sotto -70 gradi Celsius.
3

Ricostituire l'autore NADH con 1,2 ml di ddH2O . Mescolare delicatamente la soluzione fino a quando non è completamente sciolto . Non vortice.
4

serie Ricostituire NADH con 200 microlitri di puro dimetilsolfossido .
Preparazione del campione
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Lavare le cellule con PBS .
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pellet 2x10 ( 5 ) cellule per ogni singola prova in un tubo micro- centrifuga e gestito a 2.000 giri per 5 minuti .
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estrarre le cellule con 400 microlitri di tampone di estrazione NAD /NADH mediante congelamento e scongelamento delle cellule in due cicli - 20 minuti su ghiaccio secco e 10 minuti a temperatura ambiente . Vortex la cellule estratte per esattamente 10 secondi .
8

girare i campioni di cellule in un micro- centrifuga a 14.000 RPM per 5 minuti esatti .
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Trasferire il NAD /cellule NADH in una provetta pulita .
Assay protocollo
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Diluire 10 microlitri della norma NADH con 990 microlitri di buffer di estrazione NAD /NADH . Aggiungere 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 microlitri della soluzione diluita in una piastra da 96 pozzetti in duplicato per creare 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 standard ben . Riempire l'ultimo bene con 50 microlitri di tampone di estrazione NAD /NADH .
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Transfer 50 microlitri di campioni di cellule estratte in una piastra a 96 pozzetti in duplicato come prima .
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preparare i campioni di cellule per la rilevazione NADH . Scomporre il NAD dai campioni di cellule mettendo 200 microlitri di campioni di cellule estratte in provette Eppendorf . Riscaldare le provette a 60 gradi Celsius per esattamente 30 minuti in un bagno d'acqua a temperatura controllata . Raffreddare rapidamente i campioni ponendo le provette su ghiaccio . Spin i campioni nel micro - centrifuga per rimuovere precipitati . Trasferimento 50 microlitri di campioni scomposto in una piastra a 96 pozzetti in duplicato come prima .
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Mescolare il NAD ciclismo mix tampone con 100 microlitri di NAD ciclismo mix di buffer e 2 microlitri di NAD ciclismo enzima . Aggiungere 100 microlitri di questa nuova soluzione in ogni pozzetto di norme NADH e campioni .
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Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 minuti esatti . Questo processo converte il NAD in NADH .
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Aggiungere 10 microlitri di autore NADH in ogni bene . Lasciare che la piastra a temperatura ambiente per un minimo di 1 ora e un massimo di 4 ore.
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Leggere la piastra e calcolare il NADH .