Ottimizzare i blocking buffer per immunochimica: guida completa

Ruolo dei blocking buffer

I blocking buffer stabilizzano proteine rivestite in saggi immunochimici e, secondo Immunochemistry Technologies: riducono rumore nei risultati, aumentano sensibilità, efficienza e vita utile piastre rivestite, migliorano riproducibilità. Inibiscono legame aspecifico dopo che proteine e anticorpi si sono legati e assorbiti su piastra saggio durante ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Poiché gli ELISA possono essere costruiti diversamente, esistono varie scelte di blocking buffer per esigenze individuali.

Strumenti necessari

• Campione anticorpo
• Campione proteina
• Piastra saggio
• Blocking buffer
• Becher laboratorio
• Pipetta

Procedura

1. Selezione buffer: Scegliere in base al tipo ELISA:
   • General blockers (scaffold proteina mammifera) per sandwich e antigen-down ELISA
   • BB2 Neptune blocking (scaffold proteina non mammifera) per ELISA specie umane/mammifere
   • BB3 Synblocks (scaffold molecolari sintetici piccoli) per ELISA high-strength blocking
   • BB4 Phosph-free (scaffold sintetici piccoli senza fosforo) per ELISA high non-specific enzyme-labeled conjugate binding. Utile con fosfatasi alcalina, piastre reazione chimicamente trattate/vetro, microfluidica (Immunochemistry Technologies).
2. Rivestimento piastra: Versare soluzione antigene (proteina) o anticorpo sulle piastre.
3. Aspirazione: Rimuovere soluzione rivestimento inclinando piastra; eccesso in contenitore separato.
4. Aggiunta blocking buffer: Pipettare 300-400 µl buffer in ogni pozzetto.
5. Incubazione: ~3 ore o overnight a temperatura ambiente (4°C). Il buffer giusto conserva reagenti (costosi e scarsi, Cell Technology).
6. Lavaggio: Rimuovere proteine in eccesso (possono ridurre rilevazione antigene target, Pierce Net).
7. Completamento: Reazione finita: piastra con giusta quantità anticorpo legato ad antigene → risultati consistenti, ridotta variazione piastra-piastra in saggi comparativi grandi.
8. Microarray: Usare soluzione blocking avanzata (es. Array It's Block It Buffer) per inattivare gruppi reattivi residui dopo "stampa" substrati su slide super-epoxy, super-amine, super-aldehyde. Mantiene nitidezza segnale, previene fluorescenza, riduce rumore. Durata 1 anno se conservato correttamente, purezza estrema, pronto all'uso concentrato.