Molecular Cloning Protocolli

protocolli di clonazione molecolare comprendono le procedure utilizzate per definire , isolare e replicare una sequenza di DNA . Protocolli di clonazione di restrizione e legatura tradizionale avviare la frammentazione del DNA con endonucleasi limitate (enzimi che tagliano i filamenti di DNA in siti di restrizione ) , frammento di DNA legatura ( la riparazione di discontinuità in molecole di DNA ) , trasfezione ( l'introduzione di acido nucleico in un corpo cellulare ) e la selezione ( la scelta di genomi individuali per la replica ) . Isolamento

Protocolli per l'isolamento di un frammento di DNA , il primo passo nella clonazione molecolare , spesso incorporano una reazione a catena della polimerasi ( PMR ) , che utilizza cicli di riscaldamento e raffreddamento per amplificare frammenti di DNA . Per raggiungere la dimensione sequenza obiettivo , altri protocolli includono sonicazione DNA , reazione enzimatica digestione e l'uso di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente . Questi protocolli variano a seconda della grandezza e della quantità di DNA isolata necessario.

Legatura

Protocolli per la legatura comportano l'uso di un enzima, la DNA ligasi , per unirsi molecole di DNA insieme un legame covalente . Protocollo impone che unisce frammenti di DNA , il vettore di clonazione , un buffer legatura , la DNA ligasi e acqua sterilizzata in una provetta e incubare una notte a 4 gradi centigradi.
Transfezione

protocolli

per trasfezione , o infondendo DNA in una cellula mediante mezzi non virali , spesso comportano iniettando DNA direttamente nel citoplasma cellulare . Altri metodi includono l'utilizzo di reagenti chimici, come il fosfato di calcio e lipidi, per fornire il complesso trasfezione attraverso la membrana cellulare . Questo metodo verifica gli effetti della modificazione genetica sul funzionamento di specifici geni .
Selezione

selezione , o di screening , protocolli determinano quali cellule svolta con successo l'inserto di DNA ed indicano che le cellule hanno bisogno di isolamento. Una centrifuga raccolti cellule che contengono il DNA trasfettato , che vengono poi incubate in un lisozima ( un enzima naturale ) buffer e trattati con un detergente alcalino , dando le proteine ​​e membrane solubilità . Utilizzo acetato per precipitare le proteine ​​, una centrifuga e garza filtrare il supernatante contenente DNA - ( il liquido solubile restante da un composto centrifugato ) . Il supernatante viene precipitato con polietilene glicole , centrifugato , e sospesa in un tampone di cloruro di cesio e bromuro di etidio . Il bromuro di etidio macchiano il DNA secondo la densità , e con una luce UV a onda lunga , il DNA inferiore banda viene estratto con una siringa cinque cc . Una colonna di scambio ionico equilibrata separa il DNA dal bromuro di etidio e cloruro di cesio , e il pellet di DNA finale viene sospeso in una soluzione tampone e rilevato su elettroforesi su gel di agarosio .