Come faccio a Line Up DNA per l'analisi ?

Elettroforesi su gel di agarosio è il metodo più comune di visual analisi del frammento di DNA , che consente ai tecnici di frammenti di DNA visivamente discernere in base alle dimensioni . Il gel di agarosio sostiene un campo magnetico e , dato che il DNA ha una carica negativa , si muove verso il polo positivo del campo magnetico . Frammenti di DNA più piccole si muovono più rapidamente attraverso il gel e frammenti più grandi si muovono più lentamente . Frammenti di DNA vengono fluorescente colorato con un agente intercalante noto come etidio bromuro . Questo permette la comparazione di diversi campioni di DNA elettroforesi su un gel . Cose che ti serviranno
gel di agarosio , 0,7 per cento al 2 per cento
Tris - borato - EDTA ( TBA ) , tris - acetato - EDTA ( TAE ) , acetato di sodio litio ( LA) , acido borico ( SB ) tampone
etidio bromuro
Gel loading dye
vassoio gel elettroforesi
camera
Guanti
occhiali protettivi
Pipetta
elettroforesi pettine
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Preparazione di un 0,7 per cento di agarosio Gel
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Pesare 0,7 grammi di polvere di agarosio e poi mettere in un grande (250 ml ) beuta .
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Aggiungere 100 ml di un buffer 1X ( forza normale ) ( TAE , TBE , SB o tampone LB ) alla beuta contenente la polvere di agarosio .
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microonde o calore con un bruciatore Bunsen per circa un minuto fino a quando la soluzione diventa chiara e l'agarosio si è dissolto .
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Togliere il pallone dalla fonte di calore e lasciare raffreddare a 55-60 gradi Celsius .
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Aggiungi 1 ml ( microlitro ) di bromuro di etidio alla soluzione di agarosio raffreddata con un pipetta di dimensioni appropriate , di solito 1 ml . Agitare la soluzione per miscelarla.
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Versare il gel lentamente nel vassoio gel , assicurando non si ha formazione di bolle durante questo processo . Se non ci sono dighe forniti bene con il vassoio gel , usare nastro adesivo per formarli .
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Inserire un pettine elettroforesi attenzione nel gel , assicurando una posizione ferma e con l'orientamento corretto . Pettini elettroforesi possono variare notevolmente dal numero di denti che hanno. Lasciare il gel da impostare per circa 25 minuti
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Immergere il gel nello stesso tampone utilizzato per preparare la soluzione agaorse - . In questo caso , un buffer 1X . Immergere il gel in un massimo di 5 ml di tampone di corsa .
Preparazione e caricamento del DNA nel gel di agarosio per l'Analisi
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Trasferimento da 5 a 10 ml di il campione ( s) dai loro tubi di reazione alle provette freschi. Nel caso in cui si desidera utilizzare l'intera miscela di reazione , una nuova provetta non è necessario .
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Aggiungi il tampone di caricamento 0.2X a ciascuno dei vostri provette contenenti freschi vostro campione di DNA per il caricamento.
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Togliere il pettine elettroforesi lentamente , assicurando che non si rompono il gel o creare qualsiasi spazio tra il fondo del gel e il vassoio gel .
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Aggiungi a cinque a 12 microlitri di un marcatore DNA appropriato al primo pozzo creato dal pettine elettroforesi . Che si tratti o meno di un marcatore del DNA è appropriato dipende dalle dimensioni dei frammenti che si aspettano dal campione .
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Load cinque a 10 ml di vostri campioni nei restanti pozzetti e aggiungere una pari quantità dello stesso marcatore DNA nel pozzo finale .
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Porre gli elettrodi nella camera di elettroforesi collegando i cavi nelle prese corrette nella camera e impostare l'elettrodo a 50 a 150 V.

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Lasciare che il gel di correre per una a quattro ore .
analisi dei risultati
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Rimuovere il gel dalla camera gel e posizionarlo sia in una camera UV per l'identificazione visiva , o posto in una macchina che è in grado di scattare una fotografia del gel .
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Misurare la distanza marcatori della migrazione nei loro pozzi .

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tracciare le distanze contro la dimensione delle bande su carta millimetrata semilogaritmica e tracciare una linea migliore vestibilità .
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Calcolare le distanze dei tuoi gruppi sconosciuti .

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Stimare le dimensioni delle vostre band sconosciute tracciando una linea dal la distanza percorsa dai vostri gruppi sconosciuti che incontra la retta di regressione .
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Tracciare un'altra linea da questo punto di incontro verso l'asse dimensioni .